肺組織細胞內(nèi)膽固醇及代謝物水平檢測方法初探.pdf

1、目的：
　　建立高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）的方法對肺癌細胞系A(chǔ)549細胞內(nèi)膽固醇濃度和肺組織內(nèi)27羥基膽固醇（27-OHC）水平有效進行定性定量分析，為以細胞內(nèi)膽固醇含量作為指標(biāo)鑒定組織細胞泡沫化程度以及探討CYP27通路參與膽固醇代謝的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　A549細胞超聲裂解后，用KOH乙醇溶液和三氯乙酸分別除去細胞裂解液中的甘油三酯和蛋白，再以正己烷—異丙醇的二元提取劑

2、將細胞內(nèi)的膽固醇進行萃取。膽固醇含量采用 HPLC法測定，色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相為乙腈—異丙醇（67:33），流速為1 mL·min-1，檢測波長為206 nm。
　　定量稱取肺組織，施行高速勻漿法，獲得勻漿液。按勻漿液：氯仿（3：5）加入氯仿萃取。有機相用水沖洗直至中性，氯仿在減壓條件下移去。加入衍生化試劑0.1 ml三甲基氯硅烷/六甲基二硅氮烷/吡啶（1:2:3）60℃

3、反應(yīng)60 min，氮氣吹干，氯仿復(fù)溶，進GC/MS分析。色譜柱為 HP-5MS石英毛細管柱，電離方式（EI）正離子掃描，單次進樣1.0μl，載氣為氦氣。利用氣質(zhì)聯(lián)用方法分析肺組織內(nèi)27-OHC的水平。
　　結(jié)果：
　　利用本實驗所建立的 HPLC檢測方法，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為8.2 min，5 ng·μL-1—100 ng·μL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R=0.9999）；細胞內(nèi)膽固醇和半數(shù)量胞內(nèi)膽固醇出峰時間均與標(biāo)準(zhǔn)品

4、溶液出峰時間一致，均在8.2 min處出峰。胞內(nèi)膽固醇定量檢測，進行方法學(xué)驗證，其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，RSD均低于3.0%，平均加樣回收率為94.89%，RSD為2.86%（n=6），檢測限為2.665 ng·μL-1（S/N=3）定量限為10.197 ng·μL-1（S/N=10）。
　　利用氣質(zhì)聯(lián)用方法檢測，肺組織內(nèi)27羥基膽固醇碎片總離子流在55.39 min出峰，衍生化后的碎片質(zhì)荷比為m/z456，m/z546。

5、可以將其定性測出。對其定量檢測，進行方法學(xué)驗證初步預(yù)測，所測單次樣品的加樣回收率部分?jǐn)?shù)值在92%—105%范圍之外。其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等方法學(xué)驗證指標(biāo)有待進一步優(yōu)化。
　　結(jié)論：
　　本文所建立HPLC檢測的方法準(zhǔn)確、精密度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、操作簡便，回收率也在符合要求的范圍內(nèi)，經(jīng)方法學(xué)驗證，后續(xù)可用于A549細胞內(nèi)的膽固醇水平的批量檢測；為進階探討肺組織損傷與膽固醇代謝失調(diào)的病理進展關(guān)系奠定基礎(chǔ)。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)