2015學(xué)年22《土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)》課時(shí)1課件

1、,,課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,,1.分離微生物的原理2.利用選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌3.統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)目的方法,簡要地介紹尿素的發(fā)現(xiàn)過程以及尿素合成的歷史，引導(dǎo)學(xué)生閱讀“課題背景”知識(shí)，使學(xué)生明確分解尿素的細(xì)菌的重要性，突出課題研究的重要意義，設(shè)計(jì)問題，導(dǎo)入新課。知道了細(xì)菌分解尿素的原因后，我們?cè)搹氖裁礃拥耐寥乐蟹蛛x分解尿素的細(xì)菌呢？首先結(jié)合教材上科學(xué)家成功分離Taq細(xì)菌的案例，分析得出分離微生物的

2、一般規(guī)律，再結(jié)合本節(jié)的目之一：要分離分解尿素的細(xì)菌，進(jìn)入選擇培養(yǎng)基的學(xué)習(xí)。知道了分離方法后，我們?nèi)绾螌?duì)土樣中分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)呢？從而逐層深入依次討論統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法及設(shè)置對(duì)照的作用。 在充分分析Taq細(xì)菌分離案例的過程中，讓學(xué)生理解生物與環(huán)境的適應(yīng)性，從而真正明白分離微生物的原理，并能從邏輯上給出分離微生物的大致思路，這也為選擇培養(yǎng)基的學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)，并添加典型實(shí)例，讓學(xué)生更好地理解選擇培養(yǎng)基的作用。通過視頻的直觀性

3、讓學(xué)生掌握細(xì)菌計(jì)數(shù)的一般方法。,尿素的發(fā)現(xiàn)歷史,1773年，伊萊爾·羅埃爾（Hilaire Rouelle）發(fā)現(xiàn)尿素。1828年，德國化學(xué)家弗里德里希·維勒首次使用無機(jī)物質(zhì)氰酸銨（NH4CNO，一種無機(jī)化合物，可由氯化銨和氰酸銀反應(yīng)制得)與硫酸銨人工合成了尿素。本來他打算合成氰酸銨，卻得到了尿素。尿素的合成揭開了人工合成有機(jī)物的序幕，實(shí)際上開辟了有機(jī)化學(xué)。,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素

4、不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。,1.怎樣才能從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌呢？,二、研究思路,（一）篩選菌株,a.提出的問題 —如何尋找耐高溫的酶？b.解決問題的思

5、路 —尋找耐高溫環(huán)境；c.原理 —高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，耐高溫菌種提取耐高溫酶。,尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,啟示：,:要分離某種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等方法： ⑴抑制大多數(shù)微生物不能生長， ⑵造成有利于該菌生長的環(huán)境。結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,

6、（二）實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。,概念：選擇培養(yǎng)基 在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離自生固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分

7、離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞,KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 瓊脂 15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1000mL。,（1）該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？ （2）此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？,碳源：葡萄糖、尿

8、素,氮源：尿素,能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。,（三）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需 培養(yǎng)基,缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基能夠選擇出分解尿素的微生物。,（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,（1）方法：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小

9、的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,（2）缺點(diǎn),顯微鏡直接計(jì)數(shù)法,（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,2、活菌計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法) （1）操作方法： 稀釋涂布平板→統(tǒng)計(jì)菌落數(shù) （2）原理： 1個(gè)菌落→1個(gè)活菌 （3）統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)表示。 每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V)* M 其中C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)； V:所用稀

10、釋液的體積； M:稀釋倍數(shù)。,當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，固體培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。,,例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作

11、為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。,甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個(gè)平板） 乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值,你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯(cuò)在哪？,（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,2、活體計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法),①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，

12、一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。,計(jì)數(shù)法,,顯微鏡直接計(jì)數(shù)活菌計(jì)數(shù)法比濁法膜過濾法,（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,在做本課題實(shí)驗(yàn)時(shí)，利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過程中，從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 1、A同學(xué)篩選出150個(gè)菌落。 2、B同學(xué)篩選出50個(gè)菌落。 B認(rèn)為A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能

13、分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A確認(rèn)自己的操作無誤，只是自己所用的土壤樣品不同，但此時(shí)也拿不出能令人信服的證據(jù)。 請(qǐng)你幫助A同學(xué)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，提供具有說服力的證據(jù)。,分析：一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì))。 究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在

14、操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,1、設(shè)置對(duì)照的目的： 排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。 對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了 被測試 的條件外，其他條件都 相同 的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為 對(duì)照組，未滿足該條件的稱為 實(shí)驗(yàn) 組。,（五）

15、設(shè)置 對(duì)照,土壤中分解尿素的分離與計(jì)數(shù)(1),1.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ?。?A.培養(yǎng)細(xì)菌　　 B.培養(yǎng)真菌　　 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別,D,C,3.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有 （ ）

16、 ①涂布平板法 ②重量法 ③直接計(jì)數(shù)法 ④比濁法 ⑤ 生理指標(biāo)法 ⑥ 膜過濾法 A.①②③⑥ B.③④⑤⑥ C.②③④⑥ D.①③④⑥,D,5．通過配置特殊的培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。下列哪項(xiàng)操作最終不能達(dá)到分離出相應(yīng)微生物的目的(　　)A．在無氮培養(yǎng)基上可從多種細(xì)菌中分離出圓褐固氮菌B．在缺乏有機(jī)碳源的培養(yǎng)基上可以