慢性乙肝致炎的細胞分子機制

1、慢性乙肝致炎的細胞分子機制慢性乙肝致炎的細胞分子機制孫琳畢惠娟王健摘要：摘要：慢性乙肝是一種由HBV介導的以肝臟局部多種炎性細胞浸潤的慢性感染性疾病。HBV侵入機體后能否形成慢性感染與病毒是否變異、宿主抗病毒免疫應答強弱等因素密切相關。免疫耐受、Th1Th2失衡、HBV肝外PBMC感染等是導致乙肝持續(xù)感染遷延難愈的重要原因。機體對在清除侵入的病毒時，可對受感染的肝細胞產(chǎn)生一定程度損傷，如CTL通過分泌穿孔素和表達Fasl等途徑誘導靶細胞

2、凋亡；肝臟中嗜中性粒細胞和單核巨噬細胞通過產(chǎn)生反應氧（ROS）、一氧化氮（NO）等反應氮等中間產(chǎn)物，介導損傷受感染的肝細胞，在局部形成以單核巨噬細胞浸潤為主炎性損傷和炎性反應。關鍵詞：關鍵詞：慢性乙肝；致炎；分子；機制慢性乙肝是一種由HBV感染引起的以局部單核細胞、淋巴細胞及中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤為主的感染性疾病。全球約慢性乙肝約有3.5~4億，其中，我國約有3000萬。HBV侵入機體后，一方面，在宿主細胞內(nèi)復制增殖，產(chǎn)生大量病毒抗

3、原，誘導機體產(chǎn)生大量的調節(jié)性T細胞，對全身免疫系統(tǒng)造成很大壓力，致使機體免疫功能低下。另一方面HBV作為一種抗原，誘導機體的細胞免疫反應對其產(chǎn)生免疫清除，此過程可引起部分肝細胞損傷，介導局部炎癥細胞浸潤，機體為保護肝細胞不受過度損傷，肝細胞自身可表達一些免疫抑制分子，通過與相應的受體或配體結合，形成免疫抑制途徑，抑制宿主的抗病毒免疫應答，使病毒持續(xù)復制增殖，病程慢性化。本文圍繞國內(nèi)外慢性乙肝致炎的細胞分子機制研究進展進行綜述。1.HBV

4、的結構HBV是一種部分環(huán)化的雙股DNA，由一條較長且固定的負鏈(3200bp)和一條較短長度不定的正鏈(4001900bp)組成，兩鏈的5′末端有長達250~300個互補的堿基，通過堿基配對構成部分環(huán)化的雙股DNA結構。1970年Dane′s通過電鏡從澳大利亞土著人血液中發(fā)現(xiàn)了完整的乙肝病毒顆粒，2009年Kamili等[1]以免疫電鏡觀察用抗HBs的多克隆抗體處理樣品，發(fā)現(xiàn)還存在22nm絲狀的亞病毒顆粒；1979年Galibert等將

5、HBVDNA負鏈劃分為4個開放讀碼框(openreadingframeF)，其總長為4.7kb，分別為S、C、P、X區(qū)。SF長度為1185bp，有S、PreS1和PreS23個功能區(qū)，編碼外膜蛋白。S區(qū)定位于nt155833，由678個核苷酸組成，編碼226個氨基酸的S蛋白，主要是小蛋白（SmallproteinSP）或表面抗原，即HBsAg，是HBV疫苗研制的靶點。PreS1基因長度不定，定位于nt28483204，編碼119個氨基酸

6、殘基，是HBV與肝細胞膜直接結合位點[2]。董菁等[3]應用長距離精確PCR技術（LAPCR）研究發(fā)現(xiàn)在PreS1區(qū)之前還存在一個F，暫命名為前前SF，長度135bp，編碼45個氨基酸。PreS2基因長度固定，定位于nt3205154，編碼55個氨基酸外膜蛋白，具有很強的免疫原性，其120~145位氨基酸殘基是HBV的重要免疫原性決定區(qū)，可誘導中和抗體的產(chǎn)生，研究證實PreS2蛋白含有聚合人血清白蛋白（PHSA）受體，肝細胞表面也存在P

7、HSAR，這樣HBV顆?？赏ㄟ^PHSA與肝細胞膜結合，從而介導HBV入侵肝細胞，成為HBV侵入肝細胞的主要途徑[4]。CF分為C區(qū)和前C區(qū)，分別編碼183185個氨基酸的多肽即HBcAg、29個氨基酸的殘基和核衣殼蛋白HBeAg。HBcAg和HBeAg是由同一基因編碼，序列大部分相同，都是抗病毒免疫的重要靶位。前C區(qū)極易發(fā)生突變，可造成HBeAg的分泌水平下降或終止。P區(qū)是HBVDNA序列中最長的F，與S、C、X基因均有重疊，編碼P蛋白

8、，是病毒復制的主要功能單位。P區(qū)包括4個編碼區(qū)域，從氨基端開始分別為：①末端蛋白區(qū)(TP)，逆轉錄過程中與負鏈DNA5′端結合，引導HBV負鏈的合成。②間隔區(qū)(SD)，該區(qū)耐受突變。③逆轉錄酶區(qū)(RT)，該蛋白同時具有依賴RNA的RNA聚合酶活性和依賴RNA的DNA聚合酶活性。④核糖核酸酶(RNase)H區(qū)，它可裂解逆轉錄過程中形成的RNADNA雜交體中的RNA。X區(qū)位于C區(qū)的上游，是病毒基因中最小的F，其編碼含145~154個氨基酸的

9、蛋白質HBx。Yang等[5]對研究發(fā)現(xiàn)在HBV基因組中存在PreX基因，將HBV基因通過PCR法擴增并轉載至質粒中進行克隆全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)60%的HBV基因編譯PreX蛋白，PreX蛋白可通過反式激活病毒增強子Ⅰ促進HBV的復制，HBx還可激活DNA合成從而促進靜止的成纖維細胞增殖。2.HBV的復制HBV病毒通過特異性受體結合至宿主細胞膜后，通過吞飲或融合的方式穿入細胞膜，脫去蛋白質衣殼，將病毒DNA基因組釋放入細胞核，在細胞D

10、NA聚合酶和RNA聚合酶的作用下形成共價閉合環(huán)狀DNA（covalentclosedcircularDNAcccDNA），其作為HBV復制的原始模板，轉錄成為各種不同分子量的mRNA，主要有3.5KbmRNA、2.4KbmRNA、2.1KbmRNA及0.7KbmRNA（Fig2）。3.5KbmRNA稱為HBV前基因組，它可以作為HBVDNA的模板，由P蛋白逆轉錄成全長的HBVDNA負鏈，病毒以新合成的負鏈DNA為模板，自DR區(qū)開始復制互

11、補的正鏈DNA，兩者結合成不完全環(huán)狀雙鏈DNA即HBVrcDNA。新基金項目：基金項目：安徽省自然科學基金（No:090413138），安徽省教育廳自然基金重點項目（No:KJ2009A032、KJ2007A019）作者單位：作者單位：安徽理工大學醫(yī)學院婦產(chǎn)科護理學教研室淮南232001作者簡介：作者簡介：孫琳（1964），女，副主任醫(yī)師，發(fā)表論文10余篇，獲市級科技進步獎1項。研究方向：HBV垂直傳播與免疫。序列，但是兩者的二級結構不

12、同，各有特異的抗原決定簇。HBcAg是一種顆粒性細胞內(nèi)抗原，不能通過胎盤，但HBeAg作為一種非顆粒性分泌型小分子蛋白，能通過胎盤分泌入血，經(jīng)血液循環(huán)到達胸腺。Song等[8]在臍帶血中測得HBeAg陽性率為56.9%而有的研究更是高達88%。由于抗原提呈細胞功能缺陷，導致主要組織相容性復合物HLAⅡ限制的HBeAg特異性Th細胞功能缺失，表現(xiàn)為HBeAg特異性T細胞耐受，由于兩者在T細胞識別水平上有交叉反應性，又表現(xiàn)為HBcAg的免疫

13、耐受，HBeAgHBcAg特異性Th耐受可阻止抗HBe和抗HBc的產(chǎn)生，削弱了細胞毒性T細胞的應答能力，導致病毒的持續(xù)感染，此可能是導致HBsAg、HBeAg陽性母親所產(chǎn)新生兒高感染率及慢性化的主要原因。有研究表明，CTL可刺激T細胞受體TCRCD3復合物，誘導自身Fas及其配體、腫瘤壞死因子及其受體等凋亡效應因子的表達，通過受體配體和細胞內(nèi)凋亡信號傳遞，誘導T細胞自身凋亡。宿主感染HBV后，若病毒抗原滴度較高，TCRCD3復合物所致的

14、刺激就較強，使特異性CTL產(chǎn)生活化誘導的細胞死亡(activationinducedcelldeathAICD)，致“克隆衰竭”或在高濃度的包膜抗原作用下處于麻痹狀態(tài)，導致感染慢性化[9]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Th1Th2失衡可能是HBV感染慢性化的重要機制。1986年Mosmann等首次通過小鼠T細胞克隆性分析將Th細胞（CD4T細胞）分為Th1、Th2兩個功能不同的亞群。目前研究可知Th0細胞在IL12的作用下分化為Th1細胞，在IL

15、4作用下分化為Th2細胞。Th1、Th2亞群分別產(chǎn)生不同的細胞因子，Th1細胞以分泌IL2、IL12、IFNγ和TNFβ為主，主要參與細胞介導的免疫反應及細胞毒作用，并在抵御病毒等細胞內(nèi)致病因子方面起重要作用。因此Th1細胞占優(yōu)勢，細胞免疫加強，肝臟的炎癥反應較強烈，有利于HBV清除，傾向于發(fā)生急性自限性感染；Th2細胞則以分泌IL4、IL5、IL6、IL10等為主，主要介導機體的體液免疫反應，在抵御細胞外致病因子方面發(fā)揮作用，Th2細

16、胞占優(yōu)勢，機體清除病毒的能力下降，傾向于發(fā)生HBV感染的持續(xù)慢性化。越來越多的研究表明，Th1Th2失衡在機體免疫應答平衡中起著關鍵作用。病毒性肝炎的進展、預后與宿主免疫功能狀態(tài)密切相關，Th1Th2失衡與HBV感染后的轉歸有著密切的關系。Akpolat等[10]應用ELISA方法測CHB患者血清中的TNFα、IL4、TGFβ1水平均較對照組(肝臟的生物化學水平維持在正常水平)水平高，而IFNγ水平較對照組的水平低，并進一步證實IL4、

17、IFNγ在HBV的慢性化進程中發(fā)揮重要的作用。慢性乙肝患者體內(nèi)存在著細胞免疫功能的紊亂，HBV感染致機體Th1Th2比例失衡，使HBV感染慢性化。外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcellsPBMC）富含各種免疫活性細胞，是免疫細胞的集合體，主要為T淋巴細胞，其在機體的免疫應答中極為重要。有研究顯示，HBV除對肝細胞具有高度親和性外，還可侵犯PBMC以及淋巴結、脾等免疫活性組織細胞[1114]，并表達

18、病毒抗原，被特異性CTL識別并殺傷，未被感染的T細胞也可和可溶性HBV抗原結合而被特異性CTL識別和破壞，導致抗原的提呈功能減弱，相關抗體及免疫活化分子產(chǎn)生不足，導致HBV感染慢性化。2008年，王健等[15]用PCR的方法對157例乙肝患者PBMC內(nèi)HBVDNA進行檢測，并采用BSA系統(tǒng)平行檢測其CD3、CD4、CD8、CD4CD8和mIL2R表達水平，發(fā)現(xiàn)CD3、CD4水平較正常對照組顯著下降，CD8水平增高，二者比值下降，表明乙肝

19、患者體內(nèi)存在明顯細胞免疫功能低下，與免疫細胞受到HBV的感染密切相關。4.2HBV免疫逃避策略機體的某些組織、器官存在一些生理性內(nèi)皮屏障，導致HBV感染淋巴細胞無法到達組織或細胞不表達MHC類分子而無法參與免疫應答而逃避宿主免疫性清除。研究表明，這些組織主要包括腎、胰腺、腦以及一些內(nèi)分泌組織如睪丸、卵巢、腎上腺等，由于微血管屏障的存在，HBsAg特異性CTL不能到達HBsAg陽性的實質細胞部位，從而逃避機體的免疫，但是它提供了一個潛在的

20、病毒庫，通過持續(xù)釋放病毒，反復感染肝細胞等導致感染慢性化。HBV基因組各個區(qū)段都可發(fā)生變異。當病毒侵入人體后，在各種選擇性壓力作用下可發(fā)生變異來逃避機體的免疫攻擊。這些變異的HBVDNA可引起病毒復制和表達能力下降，使機體免疫細胞識別的抗原減少或缺失，從而逃脫宿主的免疫監(jiān)視。變異的HBV病毒抗原與HLA或TCR結合活性下降或者變異抗原與HLA或TCR結合后使其空間構象發(fā)生改變，致使變異抗原不能活化T細胞，而且占據(jù)TCR結合位點，產(chǎn)生對野

21、生型抗原識別的拮抗作用[16]，從而干擾免疫系統(tǒng)對HBV抗原的加工、提呈、識別和T細胞活化，最終導致T細胞對靶抗原的免疫耐受。HBsAg“α”決定簇是HBV各亞型的共同決定簇，具有高度免疫原性和序列保守性，S基因變異多集中在此，最常見的是G145R變異，即突變發(fā)生在145位氨基酸殘基上，由甘氨酸變?yōu)榫彼釓亩饦嬓桶l(fā)生改變，“α”決定簇結構的變異可導致HBsAg免疫原性、抗原性的改變，使之不能與單克隆抗α抗體及免疫疫苗接種后抗體或恢復

22、期血清抗體結合或結合力下降，導致HBV清除能力下降，形成免疫逃避[17]。Waters等[18]通過體外實驗證明了G145R突變株的免疫原性及與抗HBs的結合力均發(fā)生明顯變化。另外S基因的變異還可出現(xiàn)HBsAg陰性的HBV感染。PreC基因是HBV基因組的高變區(qū)。1989年Carman等[19]首次報道了PreC基因nt1896G→A突變，這種突變是最為常見的，可導致HBeAg合成終止，從而使血清中HBeAg呈陰性。對于由T細胞和抗體介