枇杷葉三萜酸對慢性支氣管炎防治作用的細胞分子機制研究.pdf

1、目前對慢性支氣管炎的治療主要著眼于抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘作用的研究，至今尚無令人十分滿意的藥物。而對于改善機體免疫功能狀態(tài)的免疫調(diào)節(jié)藥物，尤其是具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥的研究還沒有引起足夠的重視。本課題組前期在國家自然科學基金的資助下(NO：30371766)證實楷杷葉的有效活性部位為三萜酸。枇杷葉三萜酸(TAL)具有明顯的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，對慢支具有防治作用。 鑒于慢性支氣管炎免疫功能紊亂的病理機制和枇杷葉三萜酸(TAL)高效、低毒

2、的作用特征，基于AM在慢支發(fā)病中的重要作用，本實驗以肺泡巨噬細胞(AM)為研究靶點，探討TAL對慢性支氣管炎防治作用的細胞分子機制，為將其開發(fā)為治療慢支的新藥提供試驗依據(jù)。前期研究表明TAL灌胃給藥可明顯降低慢支大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-8水平，升高IL-10的表達，并對慢支大鼠氣道粘膜上皮細胞NF-kB、ICAM-1的蛋白表達具有一定的抑制作用。TAL能明顯抑制慢支大鼠AM自由基的產(chǎn)生[5]；抑制炎癥介質(zhì)PGE2及LTB4的合

3、成及釋放[6]；抑制AM中iNOS的表達及NO的合成；此外通過抑制NF-kB表達及活化，降低AM中TNF-α、IL-1的表達和分泌[7]。TAL既能抑制AM細胞因子(TNF-α、IL-8、IL-1)炎癥介質(zhì)(PGE2、LTB4)的表達又明顯抑制AM自由基、iNOS的合成。但AM是如何被激活的以及炎性介質(zhì)的生成與釋放機制一即基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是如何調(diào)控的目前還不明了。因此進一步研究AM等細胞激活的分子機制是CB發(fā)病機制研究的主要方向。鑒于M

4、APK信號傳導通路在炎癥反應中的重要作用，本課題旨在前期研究的基礎(chǔ)上，以AM為平臺，MAPK信號通路為研究對象，研究慢支大鼠AM MAPK信號傳導通路，探討TAL對其信號傳導通路的影響，研究TAL對慢支大鼠AM凋亡的影響，從而進一步闡明TAL對慢性支氣管炎防治作用的細胞分子機制，為將其開發(fā)為治療慢支的新藥提供試驗依據(jù)。課題為國家自然科學基金資助項目(NO：30572355)。 研究內(nèi)容主要包括以下三個方面： 1.慢支模

5、型大鼠肺泡巨噬細胞細胞因子、炎癥介質(zhì)的MAPK信號通路研究MAPK三條通路的特異性阻制劑均能顯著抑制慢支模型大鼠AM異常增加的IL-1、TNF-α活性，而JNK，ERK MAPK通路的特異性阻制劑Curcumin，PD98059能顯著抑制慢支模型大鼠AM異常增加的PGE2活性(P<0.01)。JNK,ERK MAPK通路的特異性阻制劑可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)COX-2 mRNA及蛋白表達(P<0.01 or P<0.05)。p38 MA

6、PK通路的特異性阻制劑SB203580體外給藥可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)HO-1mRNA表達而p38，JNK MAPK通路的特異性阻制劑SB203580及Curcumin可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)HO-1蛋白表達(P<0.0lorP<0.05)。MAPK三條信號傳導通路阻制劑體外給藥均可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)TNF-α mRNA表達，而JNK，p38 MAPK通路的特異性阻制劑Curcumin，SB203580可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)TNF

7、-α蛋白表達(P<0.05)。提示慢支大鼠AM中細胞因子、炎癥介質(zhì)(COX-2、TNF-α、HO-1、IL-1、PGE2)的表達及活性分別由不同的MAPK信號傳導通路介導。MAPK信號傳導通路可分別從轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平對其表達進行調(diào)節(jié)。 2.慢支大鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)MAPK信號傳導通路及TAL的作用環(huán)節(jié)研究分別應用MAPK通路上游信號蛋白(PTK、P13K、Akt、PKC)的特異性阻制劑預處理AM，觀察下游蛋白磷酸化水平，以確定

8、轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)相關(guān)信號蛋白。結(jié)果顯示：Genistein可以不同程度的抑制PKC、P13K/Akt、MAPK通路磷酸化的程度；LY294002可以抑制P13K/Akt磷酸化的水平，同時誘導p-p38、p-JNK的高表達，對PKC/ERK這條經(jīng)典途徑的磷酸化也有一定的激活作用：CalphostinC阻斷PKC的磷酸化，對P-ERK水平有較大影響，而對p-p38和p-JNK則影響不大。推出慢支模型大鼠AM中LPS信號轉(zhuǎn)導MAPK通路可能為PTK

9、-----P13K/Akt-----JNK/P38或者PTK-----P13K-----PKC-----ERK。進一步探討了TAL對MAPK通路的轉(zhuǎn)錄前信號蛋白的作用環(huán)節(jié)。發(fā)現(xiàn)TAL對-p38，p-JNK，p-ERK，p-PKC，p-Akt皆有一定抑制作用(其中對p38和JNK磷酸化水平的抑滯效應最為顯著)，而對p-P13K，其作用不甚明顯，同時，TAL對模型組TLR4受體水平的增高也沒有明顯的降低作用。也就證明TAL，對MAPK調(diào)控可

10、能發(fā)生在P13K下游某個環(huán)節(jié)，具體機制還有待研究。 3.TAL對慢支模型大鼠肺泡巨噬細胞凋亡的影響及其可能的作用機制研究與正常組比較，模型大鼠AM凋亡率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，TAL給藥組及ERK通路抑制劑PD98059組AM凋亡率顯著升高(P<0.05 orP<0.01)。而JNK通路抑制劑Cureumin組AM凋亡率顯著降低(P<0.05)。進一步研究顯示，模型大鼠AM Bax表達降低而Bel-2表達升高(P<0.0

11、1)；TAL給藥組可顯著升高慢支大鼠AM Bcl-2表達而降低Bax表達(P<0.05 0r P<0.01)。TAL抑制慢支大鼠AM胞漿內(nèi)游離鈣濃度升高，可使慢支大鼠AM激活數(shù)量減少。TAL能明顯誘導AM的凋亡，降低AM的活性，使AM的數(shù)量減少，活性降低，從而發(fā)揮防治慢支的作用。MAPK通路參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)，其中ERK通路可能抑制細胞凋亡而JNK通路發(fā)揮促凋亡的作用。TAL對慢支大鼠AM的促凋亡作用可能與其調(diào)節(jié)AM Bel-2/Bax