人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)突變致瘤的分子機(jī)制研究.pdf

1、在體外用GM-CSF和IL-4刺激人胚胎骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向樹突狀細(xì)胞(DCs)分化的過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)和鑒定，具有腫瘤特性，命名為F6細(xì)胞株。本文旨在研究F6腫瘤細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制。 我們應(yīng)用下列方法(1)采用熒光差異顯示(FDD)技術(shù)尋找MSCs誘導(dǎo)致瘤(F6)的關(guān)鍵基因。(2)采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)技術(shù)、Westernblotting、PI染色流式細(xì)胞儀鑒定F6細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞中相

2、關(guān)基因的表達(dá)。(3)采用RT-PCR，Westernblotting，免疫組化，熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，研究nucleostemin基因在F6細(xì)胞和cos7細(xì)胞的特性。(4)利用RNAi、Westernblotting、流式細(xì)胞儀技術(shù)，探討nucleostemin對(duì)F6和U937細(xì)胞增殖的影響。(5)利用Real-timeRT-PCR定量檢測(cè)F6致裸鼠腫瘤瘤組織及人肺癌患者腫瘤組織的nuleostemin、cyclinI和siva基因

3、的表達(dá)特性。研究取得以下結(jié)果： (1)熒光差異顯示成功地分離了胚胎MSCs和F6腫瘤細(xì)胞之間的不同基因片段，TA克隆得到15個(gè)EST片段，GeneBank序列比對(duì)分析表明，這些片斷均與相關(guān)基因片斷同源，其中C356，G392和G383分別與nucleostemin，cyclinI和Siva基因同源(95％，97％，100％)。 (2)從LTEP-a-2細(xì)胞中克隆了nucleostemin的全長(zhǎng)基因(1650bp，GenB

4、ank接受序號(hào)：AY825265)，并且在大腸桿菌中表達(dá)GST-nucleostemin蛋白。觀察了它在F6和其它4種人腫瘤細(xì)胞株(LTEP-a-2，U937，SW480and95D)中的表達(dá)特性。同時(shí)，用pcDNA3.1(+)-GFP-nucleostemin轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，在4-20周內(nèi)，其細(xì)胞體積和核都增大，細(xì)胞呈巨細(xì)胞樣改變，提示細(xì)胞分裂時(shí)nucleostemin影響細(xì)胞微管和微絲系統(tǒng)。Westernblotting表明nuc

5、leostemin在F6，LTEP-a-2，U937，SW480and95D的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的表達(dá)水平比在MSCs和COS-7中明顯增高(p＜0.01-0.001，n=3)。同免疫組化染色的結(jié)果一致。 (3)SCID裸鼠實(shí)驗(yàn)表明在注射F6細(xì)胞4周后產(chǎn)生腫瘤。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示在注射F6細(xì)胞后第4周、第6周和第7周的裸鼠產(chǎn)生的腫瘤組織中Nucleostemin的表達(dá)顯著升高。在5例肺癌病人的癌組織中，該基因的表達(dá)水平明顯高于

6、癌旁組織。 (4)差異顯示，F(xiàn)6細(xì)胞內(nèi)CyclinI、Siva基因表達(dá)高于MSCs。Real-timeRT-PCR、Westernblotting均與上述結(jié)果一致。在5-asa、紫外線作用下，F(xiàn)6細(xì)胞凋亡強(qiáng)于MSCs。SCID裸鼠在注射F6細(xì)胞4周后產(chǎn)生腫瘤。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示在注射F6細(xì)胞后第4周、第6周和第7周的裸鼠產(chǎn)生的腫瘤組織中CyclinI、Siva基因的表達(dá)顯著升高。在5例肺癌病人的癌組織中，該二基因的表達(dá)水平明

7、顯高于癌旁組織。 (5)構(gòu)建了針對(duì)nucleostemin的RNAipShuttle穿梭質(zhì)粒(pShuttle-p1p2，pShuttle-p3p4)，并與Backbone重組為具有包裝能力的重組腺病毒質(zhì)粒(backbone-piP2，backbone-p3P4)。病毒轉(zhuǎn)染后，Westernblot檢測(cè)F6及U937細(xì)胞干擾組比對(duì)照組(backbone-pshuttle轉(zhuǎn)染組)nucleostemin的表達(dá)顯著減低(p＜0.01

8、，n=3)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)感染后U937細(xì)胞中NS基因明顯減低約2-3倍(p＜0.01，n=3)，細(xì)胞周期結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染該干擾基因的U937細(xì)胞10天后，干擾組細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞總S期細(xì)胞增加(43.94，43.33％VS32.07％)，G1/G0期細(xì)胞減低(44.89，45.00％VS54.74％)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾組U937細(xì)胞生長(zhǎng)第六天后細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組分別下降約47％，32％。 這些結(jié)果提示：F6腫瘤細(xì)胞的發(fā)