飲水型慢性氟中毒致腦損傷分子機(jī)理的研究.pdf

1、氟雖是人體必需的微量元素之一,但長期過量攝入會引起慢性氟中毒(Chonic fluorosis)。氟對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性表現(xiàn)為影響兒童智力發(fā)育,抑制自發(fā)性神經(jīng)活動,損害學(xué)習(xí)記憶能力等。海馬是與學(xué)習(xí)記憶密切聯(lián)系的關(guān)鍵腦區(qū),也是氟神經(jīng)毒作用的靶部位之一。已有研究證明,過量氟會損傷海馬內(nèi)的突觸超微結(jié)構(gòu),但鮮見氟影響突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的報道。突觸后致密物蛋白95(postsynaptic density95,PSD-95)是突觸后致密物的主要蛋白

2、之一,本身并無活性,N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體則是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要蛋白。PSD-95可以通過不同的結(jié)構(gòu)域串集NMDA受體其相關(guān)分子,形成信號復(fù)合物,在突觸水平轉(zhuǎn)導(dǎo)并整合興奮性信號。在突觸可塑性過程中,NMDA受體起著極為關(guān)鍵的作用。我們推測,PSD-95表達(dá)水平的變化可能會影響NMDA受體的簇集,進(jìn)而影響動物的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 自山基損傷學(xué)說被公認(rèn)為氟中毒發(fā)病機(jī)

3、制之一。該學(xué)說認(rèn)為,正常情況下機(jī)體內(nèi)出于各種抗氧化酶(如超氧化物歧化酶superoxide dismutase,SOD)和抗氧化物質(zhì)(如維生素C)的存在,自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。氟中毒發(fā)生時,體內(nèi)脂質(zhì)過氰化作用增強(qiáng),氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到破壞,從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加。SOD、MDA是目前檢測脂質(zhì)過氧化水平的常用指標(biāo),但由于受多種因素影響,特異性與敏感性不強(qiáng)。因此

4、,本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制慢性氟中毒動物模型,宏觀年觀察慢性氟中毒對大鼠腦功能的影響,微觀上選用特異性與敏感性較好的自旋標(biāo)記法檢測腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平,并采用免疫組化法(immuno-histochemical stain,IHC)檢測海馬CA3區(qū)PSD-95蛋白的表達(dá)水平。通過研究,擬篩選出腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)(海馬)氟中毒相關(guān)蛋白和因子(靶分子),為深入探討氟對中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用的分子生物學(xué)機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ),為氟中毒的早期診斷和早期治療提

5、供科學(xué)依據(jù),從而拓寬為我省氟污染區(qū)飲水型地氟病患者制定合理的綜合治療方案的思路。
　　 研究方法:192只初斷乳的雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組,即對照組(飲用自來水,水氟含量低于0.5mg/L),低氟組(飲水含氟化鈉(NaF)1.5mg/L),中氟組(飲水含NaF30mg/L),高氟組(飲水含NaF60mg/L)。各組以配制的溶液作為飲水唯一來源,自由攝食、飲水,飼養(yǎng)時間為18個月。實(shí)驗(yàn)中每三個月對動物進(jìn)行行為檢測,以開場行為檢測大

6、鼠的自發(fā)活動和探究行為,以水迷宮檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；分別在染氟中期(9個月)和染氟結(jié)束后(18個月)分兩批斷頭處死大鼠,HE染色作海馬CA3區(qū)病理學(xué)觀察,自旋標(biāo)記法檢測突觸體膜流動性的變化,免疫組化法檢測海馬CA3區(qū)PSD-95蛋白表達(dá)的改變。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、開場行為結(jié)果顯示,慢性氟中毒可抑制大鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動,使跑動格數(shù)減少(p<0.05),站立頻率降低(p<0.05或p<0.01)。水迷

7、宮結(jié)果顯示,各染氟組大鼠搜索平臺潛伏期、搜索平臺總路程普遍高于對照組,說明慢性氟中毒大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。此外,染氟濃度越大、染毒時間越長,氟的這種毒性效應(yīng)越明顯。
　　 2、突觸體膜流動性的檢測結(jié)果顯示,隨著染氟濃度的增加,16-DSA標(biāo)記的突觸體膜序參數(shù)值與旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間呈遞增趨勢(p<0.05或p<0.01),即海馬突觸體膜流動性逐漸降低。說明慢性氟中毒可導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性的改變,染氟18個月組大鼠的膜流動性變化比染氟9個

8、月組更顯著。值得注意的是,染氟9個月高氟組大鼠海馬突觸體膜序參數(shù)、旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間不升反降,基本回到低氟組的水平。
　　 3、HE染色結(jié)果顯示,慢性氟中毒大鼠海馬錐體細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞輪廓消失,細(xì)胞出現(xiàn)空泡等。IHC結(jié)果顯示,隨著染氟濃度的增加,PSD-95的表達(dá)水平呈遞減趨勢,與同齡對照組相比,p<0.05或p<0.01。提示慢性氟中毒可損傷海馬神經(jīng)細(xì)胞,下調(diào)突觸后致密物重要蛋白PSD-95的表達(dá)水平,影響NMDA等受體復(fù)合物

9、的簇集,使學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　 4、在正常衰老過程中,大鼠存在增齡性的自發(fā)活動減少,學(xué)習(xí)記憶能力降低,膜流動性下降的現(xiàn)象。而染不同濃度氟后加劇了這種趨勢,可見動物的學(xué)習(xí)記憶行為受多因素影響,衰老與環(huán)境因素(慢性氟中毒)致氧化應(yīng)激均可在宏觀上引起動物學(xué)習(xí)記憶損傷,微觀上影響突觸體膜流動性的降低和PSD-95表達(dá)水平的下降。
　　 綜上所述,飲水型慢性氟中毒可抑制大鼠的自發(fā)性神經(jīng)活動,損害空間分辨學(xué)習(xí)記憶能力；而氟可透過