荷花成花相關基因NnAP1的克隆與表達.pdf

1、荷花（Nelumbo nuciferaGaern）屬于睡蓮科，蓮屬的多年生水生草本花卉，花朵碩大，花香清淡，是我國重要的水生觀賞植物。利用轉基因技術培育新品種，是園林植物育種的研究熱點之一，目前，已經克隆出許多植物的相關成花基因，但是關于荷花的成花基因研究鮮有報道。
　　本研究以‘紅霞’為試驗材料，根據已經克隆出的荷花AP1基因的保守序列和3′片段，運用RT-PCR和RACE，克隆出荷花AP1基因的全長序列，并對其生物信息學進行分

2、析，通過相對熒光定量PCR的方法，對AP1基因在不同器官及不同發(fā)育時期中的表達特性進行了分析，同時，成功構建了AP1的植物表達載體。主要研究結果：
　　1.運用RACE技術和RT-PCR技術克隆荷花AP1基因的cDNA全長
　　利用已經獲得荷花AP1基因保守片段，設計內外引物進行5′RACE擴增，并獲得5′端序列，進行拼接獲得荷花 AP1基因的全長序列1141bp，其中開放閱讀框795bp，編碼264個氨基酸，GenBank

3、登錄號是：KF361315，命名為NnAP1。序列分析表明，AP1基因含有MADS-box和K結構域，屬于MADS–box基因家族。在GenBank中進行同源性檢索表明，NnAP1的氨基酸序列與其他植物具有很高的相似性，進化樹分析表明，它們起源于相同的祖先。
　　2.采用相對熒光定量的方法進行表達分析
　　設計熒光定量PCR引物，以荷花的18S-rRNA作為內參基因對NnAP1基因在荷花不同時期不同器官的時空表達特性進行分析

4、，不同基因的表達模式不同，實時熒光定量 PCR分析表明，AP1基因在不同發(fā)育階段的各個器官中都有表達，其中在盛花期的花中相對表達量為32.09，表達水平最高，在幼葉期和謝花期痕量表達，相對表達量平均都不足1，說明NnAP1與花發(fā)育的調控有關。3.AP1表達載體的構建
　　運用酶切方法成功構建了AP1的植物表達載體，首先構建AP1-T載體，然后進行雙酶切，將具有Nco I酶切位點的AP1-T和pCAMBIA1301進行連接，初步獲得