馬銀花等杜鵑花組織培養(yǎng)及干細(xì)胞相關(guān)基因克隆與表達(dá).pdf

1、杜鵑花是一種重要的觀賞植物，具有一定的園林綠化及藥用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)多種杜鵑花的組織培養(yǎng)進(jìn)行了一系列研究，在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究以馬銀花（Rhododendron ovatum Planch.）和滿(mǎn)山紅（Rhododendron simsii）試管苗為材料，對(duì)馬銀花的離體繁殖進(jìn)行研究，并對(duì)滿(mǎn)山紅的離體繁殖體系進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)以馬銀花愈傷組織為材料，對(duì)植物干細(xì)胞相關(guān)基因RoWUS和RoCLV1的cDNA全長(zhǎng)序列以及RoWUS基因的g

2、DNA及啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)RoWUS和RoCLV1基因在馬銀花愈傷組織不同培養(yǎng)階段以及不同激素處理下的表達(dá)水平進(jìn)行定量表達(dá)分析。主要結(jié)果如下：
　　1馬銀花等杜鵑花離體繁殖體系的優(yōu)化
　　以馬銀花和滿(mǎn)山紅試管苗為材料，對(duì)馬銀花試管苗的增殖、生根以及葉片愈傷組織的誘導(dǎo)進(jìn)行研究，并優(yōu)化滿(mǎn)山紅試管苗增殖、生根體系。①比較不同基本培養(yǎng)基、ZT、NAA、TDZ對(duì)馬銀花和滿(mǎn)山紅增殖的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果表明

3、： WPM+ZT2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+TDZ0.5 mg/L對(duì)馬銀花試管苗增殖效果最佳，增殖系數(shù)最高，達(dá)到12.92，平均株高為1.89 cm，葉片較大，莖粗壯，呈深綠色； WPM+ZT4.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+TDZ1.0 mg/L對(duì)滿(mǎn)山紅試管苗增殖效果最佳，增殖系數(shù)最高，達(dá)到8.27，平均株高為1.73cm，葉片大，莖鮮嫩粗壯，呈嫩綠色。②比較不同基本培養(yǎng)基、NAA、IBA、AC對(duì)馬銀花和滿(mǎn)山紅生

4、根的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果表明：1/4 WPM+IBA1.0 mg/L+NAA0.0 mg/L+AC3.0 g/L對(duì)馬銀花試管苗生根影響最佳，平均根數(shù)最多為9.86條，平均根長(zhǎng)為1.83 cm；1/4 WPM+IBA1.0 mg/L+NAA0.0 mg/L+AC3.0 g/L對(duì)滿(mǎn)山紅試管苗生根影響最佳，生根率達(dá)到100％，平均根數(shù)最多為10.71條，平均根長(zhǎng)為1.52 cm。③比較不同基本培養(yǎng)基、ZT、NAA、2,4-D對(duì)馬銀花葉片愈傷組織

5、誘導(dǎo)的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果表明： WPM+ZT1.0 mg/L+NAA0.15 mg/L+2,4-D1.0 mg/L對(duì)馬銀花愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率為62.22%，愈傷組織淺綠色、疏松，生長(zhǎng)狀況優(yōu)良，誘導(dǎo)所需時(shí)間最短。
　　2馬銀花愈傷組織RoWUS基因及其啟動(dòng)子的克隆與分析
　　采用同源克隆法結(jié)合RACE技術(shù)從馬銀花愈傷組織中克隆得到RoWUS cDNA全長(zhǎng)序列，登錄號(hào)為 KF365488。馬銀花RoWUS cDNA全長(zhǎng)

6、1123 bp，其中5'-UTR長(zhǎng)度為101 bp，3'-UTR長(zhǎng)度為94 bp，以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子，Poly（A)尾長(zhǎng)18 bp，編碼302個(gè)氨基酸。RoWUS蛋白相對(duì)分子量為33422.5Da，理論等電點(diǎn)（pI）5.81，分子式為C1444H2186N416O477S13，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核的可能性最高，是不穩(wěn)定的親水蛋白，無(wú)信號(hào)肽，具有跨膜結(jié)構(gòu)，包含homeodomain功能位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白以無(wú)規(guī)

7、則卷曲結(jié)構(gòu)為主，所占的比例為74.83%，其次為α螺旋結(jié)構(gòu)占15.23%，延伸鏈所占的比例較少，為9.93%。由三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明RoWUS單獨(dú)形成一個(gè)分支，與葡萄、大豆和苜蓿的親緣關(guān)系最近。
　　采用同源克隆法結(jié)合RACE技術(shù)從馬銀花愈傷組織中克隆得到RoWUS gDNA序列，序列長(zhǎng)2001 bp，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，3個(gè)外顯子在

8、DNA序列上的位點(diǎn)分別是1-370；831-946；1579-2001。
　　采用染色體步移法從馬銀花愈傷組織中克隆得到 RoWUS基因的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子長(zhǎng)3122 bp，登錄號(hào)為KF861578。核心啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明RoWUS啟動(dòng)子具有多個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)域，其中最可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?GTCGTTCATATATATATTTATGCCCGATCAAT CTGATTTTTCTCTGCGAT，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)

9、上游-1381 bp處的T（將起始密碼子ATG中的A定義為位+1）。該啟動(dòng)子中核心元件TATA-Box有57個(gè)、CAAT-Box有27個(gè)，另外還含有多個(gè)光響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、激素應(yīng)答元件和其他功能元件。
　　3馬銀花愈傷組織RoCLV1基因的克隆與分析
　　采用同源克隆法結(jié)合RACE技術(shù)從馬銀花愈傷組織中克隆得到RoCLV1 cDNA全長(zhǎng)序列，登錄號(hào)為KF861577。馬銀花RoCLV1 cDNA全長(zhǎng)3526 bp，

10、其中5'-UTR長(zhǎng)度為169 bp，3'-UTR長(zhǎng)度為363 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA，Poly（A)尾長(zhǎng)8 bp，編碼992個(gè)氨基酸。RoCLV1蛋白相對(duì)分子量為109589.3Da，理論等電點(diǎn)（pI）8.62，分子式為C4933H7845N1317O1437S31，RoCLV1蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜的可能性最高，具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，是不穩(wěn)定的親水蛋白，含有Pkinase和PROTEIN_KINASE_DOM結(jié)

11、構(gòu)域。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明RoCLV1蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主，所占的比例為51.71%，其次為α螺旋結(jié)構(gòu)占33.77%，延伸鏈所占的比例較少，為14.52%。由三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明馬銀花 RoCLV1與葡萄親緣關(guān)系最近，形成一個(gè)分支，與草莓、碧桃、番茄、馬鈴薯等的親緣關(guān)系較近。
　　4馬銀花愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中干細(xì)胞相關(guān)基因的定量表達(dá)分析
　　

12、以EF-1a為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR法對(duì)RoWUS和RoCLV1基因在馬銀花愈傷組織不同培養(yǎng)階段及不同激素處理下的表達(dá)情況進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：RoWUS和RoCLV1基因在馬銀花愈傷組織不同培養(yǎng)階段均有表達(dá)，且無(wú)論是不同繼代周期還是同一繼代周期不同天數(shù)中RoWUS的相對(duì)表達(dá)量都比RoCLV1的相對(duì)表達(dá)量要高，可以推測(cè)在馬銀花愈傷組織的發(fā)生過(guò)程中，RoWUS基因在干細(xì)胞維持和分化的調(diào)控途徑中可能起到重要作用，進(jìn)而對(duì)愈傷組織的分化起

13、重要調(diào)控作用。一個(gè)繼代周期內(nèi)不同天數(shù)和不同繼代周期中RoWUS基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)相似。一個(gè)繼代周期內(nèi)RoWUS基因在第25 d時(shí)表達(dá)量最高，不同繼代周期中RoWUS基因在第5代表達(dá)量達(dá)到峰值，而此時(shí)馬銀花愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，說(shuō)明該愈傷組織可能在該時(shí)期處于細(xì)胞分裂旺盛期。RoCLV1在第10 d、30 d和45 d時(shí)候出現(xiàn)3個(gè)峰值，說(shuō)明RoCLV1對(duì)馬銀花愈傷組織在不同時(shí)間的細(xì)胞分裂有不同的影響。
　　用赤霉素和脫落酸

14、處理馬銀花愈傷組織時(shí)RoWUS和RoCLV1基因的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。赤霉素濃度較低時(shí)RoWUS和RoCLV1基因的響應(yīng)比較弱，但是隨著赤霉素濃度的提高，RoWUS和RoCLV1基因?qū)Τ嗝顾仨憫?yīng)逐漸增強(qiáng)，在濃度為15 mg/L時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)，濃度進(jìn)一步增加時(shí)又降低。這可能是試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中含有活性較高的細(xì)胞分裂素和一定濃度的生長(zhǎng)素導(dǎo)致的。用低濃度ABA處理時(shí)RoWUS和RoCLV1基因相對(duì)表達(dá)量穩(wěn)定，但是當(dāng)ABA濃度從10 mg/L增