早實枳成花相關基因啟動子的分離與功能鑒定.pdf

1、開花是植物生命活動過程中的重要階段,探尋植物開花的機理有助于縮短童期,加速植物育種進程。在生物體內,基因的表達和調控是生物體代謝、發(fā)育、生殖等一系列生理活動的根本所在?；虻奶禺愋员磉_決定了生物體的特異性,啟動子是直接調控基因特異性表達的重要元件,它決定了基因表達的強度、時間和空間等特異性。柑橘LEAFY(LFY)同源基因是促進植物成花的基因,TERMIANL FLOWER1(TFL1)同源基因是抑制植物成花因子。研究它們的表達調控機理

2、對闡明基因功能,探索木本植物成花機制具有極大的意義。本研究以柑橘早花突變體早實枳(Precocious Trifoliate Orange)為試驗材料,研究了兩個關鍵基因PtTFL和PtLFY在早實枳成花轉變過程中的表達特點及他們的表達調控特征,獲得的主要結論如下:
　　 1.實時定量PCR分析了在早實枳成花轉變期PtLFY基因的表達,結果表明,PtLFY基因的表達隨著植株生長發(fā)育而變化,在夏秋季表達低,12月份表達開始上升,1

3、月份表達最強,并維持至3月份,之后mRNA表達隨即下降。早實枳在4月份進行花芽分化,這個變化趨勢說明PtLFY基因與早實枳的成花轉變密切相關。
　　 2.從早實枳和普通枳基因組中分離到PtLFY啟動子2185 bp,兩者同源性高達99％。在線分析軟件表明該啟動子轉錄起始位點A(+1),TATA box和CAAT box位于-30 bp和-63 bp,含有6個赤霉素感應元件,2個脫落酸感應元件,5個光感應元件和3個日照節(jié)律元件。此

4、外,PtLFY啟動子還含有兩個甲基化島,暗示表觀調控可能也參與了PtLFY基因表達。
　　 3.將PtLFY:GFP載體(De10)基因槍轟擊洋蔥表皮細胞,結果表明,在洋蔥表皮細胞核和細胞膜中均有綠色熒光,能驅動GFP表達。PtLFY全長啟動子(Del1)轉入擬南芥的穩(wěn)定研究結果顯示,該啟動子在擬南芥童期和成年期均有活性,且GUS表達主要集中在植物的頂端生長點,其活性隨童期年齡的增加而增加,同時GUS在成年態(tài)植株早期花器官和果實

5、中也有強烈表達。
　　 4.構建5個PtLFY5’缺失啟動子體,命名為Del2～Del6。除Del6外的缺失啟動子都能啟動子GUS表達,推測該啟動子的關鍵元件位于-634～+1 bp。Del2～Del5缺失體均具有頂端分生組織專一性表達特點,也各有特異性。果莢中的表達僅在Del1和Del2出現(xiàn)；花發(fā)育的早期,僅Del1啟動子可在花瓣表達；在根中的表達也僅在Del1中出現(xiàn)。各缺失啟動子活性大小不一,比較植株25 d時5個啟動子(D

6、el6除外)活性,Del2活性為Del10.9倍,Del3活性為Del10.67倍,Del4與Del1活性相當,Del5活性最高,為Del11.2倍。
　　 5.轉基因擬南芥用激素及光照處理后,比較Del1啟動子在植株生命活動中的最大啟動子活性,赤霉素處理下Del1增加至1.02倍,脫落酸增加至1.2倍,短日照降低至0.6倍,短日照下赤霉素處理活性為0.8倍。赤霉素處理條件下,與長日照未處理植株比較Del2～Del5缺失啟動子最

7、大活性,Del2增加至1.2倍,Del3增加至1.7倍,Del4增加至1.3倍,Del5增加至1.2倍。將Del1,DeL2和Del5轉基因擬南芥用脫落酸處理,在植株25 d時與對照比較活性,Del1的活力增加至1.2倍,Del2增加至2.1倍,Del5下降至0.56倍。
　　 6.實時定量PCR分析了在早實枳成花轉變期PtTFL基因的表達,結果表明PtTFL在早實枳童期表達較高。在成年態(tài)植株中成花轉變到來前(1月份)表達量最高

8、,轉變期時表達量降至最低,在成年態(tài)營養(yǎng)器官,如根、莖、葉和花器官、果實中均有很高表達。這實驗說明早實枳PtTFL基因維持植物營養(yǎng)生長并抑制植物成花。
　　 7.分離了早實枳PtTFL啟動子1287 bp,生物信息學分析發(fā)現(xiàn),PtTFL啟動子TATA box和CAAT box,位于-31bp和-290bp。PtTFL啟動子含有2個赤霉素感應元件,2個光誘導元件和1個脫落酸類似元件。擬南芥轉.PtTFL啟動子表達發(fā)現(xiàn),PtTFL啟動

9、子在童期的活性隨著植株年齡的增長而增加,且表達部位集中在植物生長點附近,僅在成年態(tài)莖和葉中有表達,花器官不表達。赤霉素處理對PtTFL啟動子的活性影響復雜,在成花轉變前使啟動子活性降低；脫落酸抑制了啟動子的活性至0.75倍,短日照處理增加PtTFL啟動子活性至對照1.3倍,短日照下噴施赤霉素使活性增至1.8倍。本實驗說明,PtTFL啟動子受到了赤霉素,脫落酸和日照長度的廣泛調控。
　　 本實驗通過對促進植物成花的關鍵基因PtLF