山葡萄ClassⅢ幾丁質(zhì)酶基因VCH3啟動(dòng)子功能鑒定.pdf

1、目前,利用誘導(dǎo)型和組織特異性啟動(dòng)子,人工構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子,來(lái)代替天然的組成型啟動(dòng)子,從而避免外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、高效表達(dá)已經(jīng)得到廣泛共識(shí).但是比較理想的、真正能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的組織特異性啟動(dòng)子不多,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子更少.該文對(duì)山葡萄ClassⅢ幾丁質(zhì)酶基因VCH3啟動(dòng)子進(jìn)行了系列片段缺失,系統(tǒng)研究了VCH3啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草NC89中表達(dá)的誘導(dǎo)活性及組織特異性,主要結(jié)果如下:1.采用PCR方法對(duì)VCH3啟動(dòng)子進(jìn)行了系列片段缺

2、失,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法對(duì)構(gòu)建的啟動(dòng)子缺失片段::GUS嵌合基因轉(zhuǎn)化了煙草NC89,并對(duì)水楊酸(SA)處理后的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了GUS活性的熒光檢測(cè),結(jié)果表明最長(zhǎng)的啟動(dòng)子片段(-1189~+7,含有兩個(gè)SA順式作用元件)驅(qū)動(dòng)了最強(qiáng)的GUS酶活性,相當(dāng)于次長(zhǎng)片段的2倍.轉(zhuǎn)VCH3(-589)GUS和VCH3(-892)GUS(均含有一個(gè)SA順式作用元件)嵌合基因的煙草根系中的GUS酶活性基本一致.VCH3(-276)GUS(無(wú)SA順式

3、作用元件)嵌合基因驅(qū)動(dòng)的GUS酶活性最低,僅僅稍高于對(duì)照.2.利用點(diǎn)突變技術(shù)突變了VCH3啟動(dòng)子中的兩個(gè)SA順式作用元件,同突變前一樣將突變后的VCH3啟動(dòng)子進(jìn)行系列片段缺失,轉(zhuǎn)化煙草,并測(cè)定SA處理后的轉(zhuǎn)基因煙草的GUS熒光活性,結(jié)果為:只含有突變的SA順式作用元件的VCH3<'*>(-589)GUS、VCH3<'*>(-892)GUS和VCH3<'*>(-1187Ⅱ)GUS(兩個(gè)SA順式作用元件均被突變)嵌合基因驅(qū)動(dòng)的GUS酶活性依

4、次漸高,但相差不多,與突變前的VCH3(-276)GUS處于同一個(gè)數(shù)量級(jí).VCH3<'*>(-1187Ⅰ)GUS(突變一個(gè)SA順式作用元件,保留一個(gè)完整的SA順式作用元件)片段驅(qū)動(dòng)了較強(qiáng)的GUS酶活性,但強(qiáng)度僅與突變前只含有一個(gè)SA順式作用元件的VCH3(-589)GUS和VCH3(-892)GUS片段相近.以上的結(jié)果表明SA順式作用元件對(duì)外源施加的SA有應(yīng)答效應(yīng),并且GUS活性的最大量表達(dá)需要兩個(gè)SA順式作用元件的協(xié)同作用.3.通過(guò)對(duì)

5、SA處理后的轉(zhuǎn)基因煙草根系進(jìn)行的GUS活性組織化學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),無(wú)論在突變前后,橫切面還是縱切面,各缺失片段驅(qū)動(dòng)的GUS活性在維管組織中表達(dá)最強(qiáng),在外皮層及內(nèi)皮層中表達(dá)較弱.從染色深淺上來(lái)看,含有兩個(gè)完整的SA順式作用元件的VCH3(-1187)GUS嵌合基因的轉(zhuǎn)基因煙草根系顏色最深,含一個(gè)完整的SA順式作用元件的VCH3(-589)GUS、VCH3(-892)GUS和VCH3<'*>(-1187Ⅰ)GUS片段的次之,只含有突變了的S