番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體ptom-gfpaada的構(gòu)建

1、1番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadA的構(gòu)建夏蓓蓓夏蓓蓓翟軍鵬翟軍鵬陳吉裕陳吉裕張香琴張香琴張興國張興國西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400716摘要：摘要：采用PrimStarHSDNA聚合酶從番茄基因組DNA中擴(kuò)增出了質(zhì)體的trnItrnA基因序列。序列分析結(jié)果表明，所克隆的基因與GenBank公布的序列完全相同，與煙草的trnItrnA基因序列同源性高達(dá)94%。將該片段作為定點(diǎn)整合外源基因的同源重組片段，構(gòu)建成包含Prrn::gfp

2、aadA::TpsbA表達(dá)盒的番茄質(zhì)體定點(diǎn)轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadA，酶切鑒定表明，所構(gòu)建的載體符合預(yù)期設(shè)計(jì)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：番茄；質(zhì)體；trnItrnA基因；載體pTomGFPaadA番茄是世界上重要的蔬菜作物之一。它色澤鮮艷、口感宜人，可鮮食、菜用和加工，能為人們提供多種天然的維生素和礦質(zhì)元素，因而深受消費(fèi)者喜愛[12]。目前，利用基因工程的方法進(jìn)行番茄品種性狀改良的研究取得了很大的進(jìn)展，但多停留對核基因組的轉(zhuǎn)化，而核基因組轉(zhuǎn)化

3、中存在位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)基因沉默及外源基因表達(dá)量低等問題。自從1990年高等植物煙草的葉綠體轉(zhuǎn)化獲得成功以來[3]，質(zhì)體轉(zhuǎn)化已經(jīng)在許多物種中獲得了成功，且以其獨(dú)特的優(yōu)越性成為植物基因工程的研究熱點(diǎn)，但除煙草以外，其他植物的質(zhì)體轉(zhuǎn)化依然難度較大[4]。質(zhì)體轉(zhuǎn)化通過同源重組的方式將外源基因定點(diǎn)整合到質(zhì)體基因組上，因此，質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體具有物種專一性。Daniel等利用煙草質(zhì)體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了可用于不同植物的通用質(zhì)體轉(zhuǎn)化載

4、體（universalvect）[5]。目前已有多種作物利用該載體實(shí)現(xiàn)了外源基因在質(zhì)體中的穩(wěn)定表達(dá)[6]，但是轉(zhuǎn)化效率很低[78]?？梢?，要解決番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化的難題，構(gòu)建番茄物種專一性的質(zhì)體基因表達(dá)載體非常必要。本研究參照已公布的番茄質(zhì)體的trnItrnA基因序列設(shè)計(jì)引物，從番茄基因組中克隆了trnItrnA基因片段，并以此作為定點(diǎn)整合的同源片段，構(gòu)建了包含GFP基因、選擇標(biāo)記基因aadA及質(zhì)體特異性啟動子Prrn和終止子TpsbA的番茄

5、質(zhì)體表達(dá)載體，其結(jié)果對提高番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化的效率具有重要的利用價(jià)值。1材料和方法材料和方法1.1材料和試劑材料和試劑材料為普通番茄（SolanumlycopersicumL.）品種AilsaCraig。pVCT2161由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。pBio3GFP、大腸桿菌菌株DH5α等由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18T載體購自TaKaRa公司。1.2方法方法1.2.1番茄基因組DNA的提取參照CTAB法提取番茄幼嫩葉片中的基因組DNA[9]。1.2.2番茄t

6、rnItrnA基因區(qū)段的克隆根據(jù)番茄質(zhì)體的trnItrnA基因序列（acc#:NC_007898），設(shè)計(jì)合成一對引物P1:5’gtattttggtttgacactgcttcacacc3’和P2:5’gtatcggctaagttcacgagttgc3’，分別位于TrnI基因的上游和TrnA基因的下游。以番茄的總DNA為模板，采用PrimStarHSDNA聚合酶（TaKaRaCo.，Japan）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：98℃1min，1

7、個循環(huán)；98℃10sec，59℃15sec，72℃2min，28個循環(huán)；72℃最后延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，再用TaqDNA聚合酶加“A”尾，TA克隆到pMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以P1P2為引物對菌落進(jìn)行PCR篩選，陽性克隆(pMDtrnIA)委托上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（30972008）作者簡介：夏蓓蓓，1984，女，湖北鐘祥人，碩士研究

8、生，主要從事蔬菜分子生物學(xué)方面的研究。通訊作者：張興國，研究員。3參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：[1]王大平.水楊酸對番茄貯藏品質(zhì)的影響[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)200830(2):7780.[2]王逸群李田.乙肝病毒表面抗原基因?qū)Ψ训倪z傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)200830(7):7883.[3]SvabZHajdukiewiczPMaligaP.Stabletransfmationofplasti

9、dsinhigherplants[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA199087:85268530.[4]MaligaP.Plastidtransfmationinhigherplants[J].Annu.Rev.PlantBiology200455:289313.圖2.2.番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadApTomGFPaadA的構(gòu)建與鑒定的構(gòu)建與鑒定A:番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTomGFPaadA的構(gòu)建

10、流程；B：番茄trnIA基因的PCR擴(kuò)增；C：pKntrnIA質(zhì)粒DNA酶切鑒定；D：pTomGFPaadA質(zhì)粒酶切鑒定；tomtrnI和tomtrnA：用于同源重組的番茄質(zhì)體DNA片段；Prrn：經(jīng)改造的煙草質(zhì)體16SrRNA基因啟動子；GFP：綠色熒光蛋白基因；aadA:原核壯觀霉素抗性基因；TpbsA：煙草質(zhì)體pbsA基因終止子；ColEI：大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子；nptⅢ：原核新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ⅲ；M:λDNAEcⅠHindⅢMa

11、rker；Lane1：trnIA基因的PCR擴(kuò)增；Lane2：pKntrnIA的質(zhì)粒DNA；Lane3：pKntrnIA的EcI和SacI酶切產(chǎn)物；Lane4：pTomGFPaadA[HindIIISacI]酶切；Lane5：pBio3GFP[HindIIISacI]酶切。AseISalI收2633bpAseISalI收2264bp番茄gDNASLtrnISLtrnABstXISacI收2197bpBstXISacI收4742bpM12