質(zhì)體定位蛋白Pt-mVirD2的編碼基因合成與T-DNA型煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建.pdf

1、葉綠體轉(zhuǎn)化具有高豐量表達(dá)目的基因、以定點(diǎn)整合方式導(dǎo)入外源基因從而消除了位置效應(yīng)及基因沉默、能按原核表達(dá)方式以多順?lè)醋拥男问奖磉_(dá)多個(gè)基因、母系遺傳方式可防止基因擴(kuò)散、基因產(chǎn)物區(qū)域化并能提供適于某些產(chǎn)物發(fā)揮功能的小環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。其應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越受到人們的重視?，F(xiàn)在絕大多數(shù)的植物質(zhì)體轉(zhuǎn)基<都采用基因槍法，也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法。此外，還有采用微注射法成功實(shí)現(xiàn)外源基因瞬時(shí)表達(dá)的報(bào)道。但是，這些方法均存在轉(zhuǎn)化效率低、同質(zhì)化時(shí)間長(zhǎng)和可

2、能同時(shí)將質(zhì)體基因污染性整合進(jìn)核基因組等問(wèn)題，已成為該技術(shù)迅速發(fā)展與廣泛利用中迫切需要解決的難題。 本研究克隆了根癌農(nóng)桿菌的VirD2基因片段mVirD2和擬南芥AtCor15a基因的質(zhì)體定位信號(hào)肽的編碼序列pt(plastid-targeted)，構(gòu)成了編碼質(zhì)體定位融合蛋白的核基因pt-mVirD2；同時(shí)，構(gòu)建帶有T-DNA結(jié)構(gòu)的煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體：以期為下一步進(jìn)行葉綠體定向轉(zhuǎn)化、解決當(dāng)前質(zhì)體轉(zhuǎn)化難度大和效率低等問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。主

3、要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了分別含有pt-mVirD2-GUS和pt-mVirD2-GFP基因的植物基因雙元表達(dá)載體 以根癌農(nóng)桿菌C58基因組、pMD-AtCor15a質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增了喪失核定位信號(hào)的mVirD2基因片段和質(zhì)體定位信號(hào)序列pt，構(gòu)建了分別含有pt-mVirD2-GUS嵌合基因和pt-mVirD2-GFP嵌合基因的植物基因雙元表達(dá)載體pVCT2155和pVCT2210。 2.將pt-mV

4、irD2-GUS和p-mVirD2-GFP目的基因分別導(dǎo)入煙草基因組，獲得轉(zhuǎn)基因植株 (1)采用葉盤(pán)法經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)在50mg/l潮霉素的篩選壓下篩選，得到潮霉素陽(yáng)性植株。經(jīng)PCR擴(kuò)增證實(shí)，目的基因pt-mVirD2-GUS整合進(jìn)了煙草基因組。 (2)采用葉盤(pán)法經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)在150mg/l卡那霉素的篩選壓下篩選，得到卡那霉素陽(yáng)性植株，將目的基因pt-mVirD2/GFP導(dǎo)入煙草。對(duì)抗性植株進(jìn)行顯微觀察能夠看到綠色熒光。