lamp技術(shù)及應(yīng)用

1、2024年3月10日星期日,LAMP技術(shù)及應(yīng)用,湖北省疾控中心結(jié)防所周麗平,LAMP技術(shù),環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一種在恒定溫度下實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)級擴(kuò)增的技術(shù)已經(jīng)被用來快速檢測動物病原(病毒、細(xì)菌、寄生蟲)LAMP技術(shù)因其特異、敏感、簡便、快捷、檢測方式對實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施、設(shè)備的要求較少，逐步用于結(jié)核分枝桿菌診斷鑒別中世界衛(wèi)生組織于2016

2、年8月11日，在日內(nèi)瓦發(fā)布了一份最新的推薦書，推薦發(fā)展中國家的基礎(chǔ)醫(yī)療單位使用該方法，可以作為痰涂片檢測方法的替代方案,“十三五”規(guī)劃要求逐步推廣的新診斷技術(shù),LAMP技術(shù)的原理 對靶基因的6個(gè)特異部位設(shè)定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增。,LAMP法使用的酶,鏈置換型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase擴(kuò)增對象為雙鏈DNA時(shí)，其中一

3、條鏈解離的同時(shí)進(jìn)行鏈延長。LAMP法使用最適溫度65℃的聚合酶。,2024年3月10日星期日,LAMP法的引物設(shè)計(jì),2024年3月10日星期日,LAMP法的原理,,2024年3月10日星期日,LAMP法的原理,,2024年3月10日星期日,LAMP技術(shù)特點(diǎn),,,LAMP法和其他PCR法的比較,2024年3月10日星期日,LAMP法和其他PCR法的比較,2024年3月10日星期日,LAMP法所需的試劑,2024年3月10日星期日,202

4、4年3月10日星期日,LAMP技術(shù)簡介,,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人員發(fā)明的一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。該技術(shù)可以在等溫條件下（約65℃）進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過反復(fù)的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下進(jìn)行連續(xù)快速的核酸擴(kuò)增，并且可以通過簡易直觀的目測判讀結(jié)果，相比傳統(tǒng)PCR大大節(jié)省了時(shí)間和

5、實(shí)驗(yàn)操作步驟。,LAMP法常規(guī)操作步驟,2024年3月10日星期日,LAMP法的檢測方法,瓊脂糖凝膠電泳法 由LAMP原理可知，LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。因此，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠糖上呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。（圖A）肉眼觀察法 在LAMP反應(yīng)過程中，可以通過產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生來肉眼直接判斷擴(kuò)

6、增反應(yīng)是否進(jìn)行。（圖B）通過熒光染料檢測 有時(shí)，通過肉眼觀察白色沉淀來檢測會存在一定的誤差，所以也可通過添加熒光染料，如溴化乙錠(EB)、SYBR GreenI等進(jìn)行染色，來檢測擴(kuò)增是否發(fā)生。（圖C）,2024年3月10日星期日,,2024年3月10日星期日,LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用,2024年3月10日星期日,靶標(biāo)限定: 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,gyrB基因作為結(jié)核分枝桿菌重要的功能基因，在復(fù)合群進(jìn)化過程

7、中非常保守，LAMP法檢測即以gyrB基因作為靶標(biāo)。臨床上感染人類的是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌。對檢測對象的準(zhǔn)確限定能避免假陽性過高而增加治療成本，長遠(yuǎn)來說，更有利于避免耐藥性的產(chǎn)生。,LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用,2024年3月10日星期日,適宜的檢測對象以臨床上引起結(jié)核感染的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為檢測對象，可避免假陽性過高。 反應(yīng)管預(yù)裝反應(yīng)體系擴(kuò)增及檢測在全

8、封閉反應(yīng)管中進(jìn)行，有效降低氣溶膠污染；用戶操作簡便、減少操作誤差。結(jié)果易讀產(chǎn)物和顯色液直接顯色即可肉眼判斷結(jié)果。,技術(shù)特點(diǎn)：,LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用,2024年3月10日星期日,臨床試驗(yàn),—— LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果,靈敏度＝89.54% 陽性結(jié)果預(yù)期值＝98.13% 特異性＝98.93% 陰性結(jié)果預(yù)期值＝93.77% 總符合率＝95.31%,LAMP法在結(jié)核菌檢

9、測中的應(yīng)用,2024年3月10日星期日,臨床試驗(yàn),—— LAMP法和對照試劑（TB-qPCR）對比結(jié)果,陽性一致率=88.56% 陰性一致率=93.06% 總符合率=91.36%,,WHO 認(rèn)為LAMP法的檢測結(jié)果優(yōu)于痰涂片檢測。在已有肺結(jié)核癥狀的檢測者中進(jìn)行對比，TB-LAMP法比痰涂片檢測法多檢出15%的患者。對比WHO近年推薦的其它快速檢測法，如果把TB-LAMP法用于對痰涂片檢測陰性患者的復(fù)查，TB-LAMP法檢出率要高40

10、%。,2024年3月10日星期日,2024年3月10日星期日,LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用,現(xiàn)有結(jié)核診斷方法和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法比較,,痰標(biāo)本目測法檢測流程,,100分鐘,,,一、樣品處理,1、用2~3倍體積的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入無菌1.5mL離心管中,,一、樣品處理,2、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清,,一、樣品處理,3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌,,一、樣品處理,4、13000r

11、/min離心10min，盡量吸棄上清5、重復(fù)步驟3、4一次,,一、樣品處理,6、向含沉淀物的離心管分別加入100μL DNA提取液，混勻后沸水浴10min,,一、樣品處理,7、冷卻至室溫后， 13000 r/min離心﹥5min，上清即為核酸模板,,二、核酸擴(kuò)增,1、向反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對照、待檢模板和陽性對照各2.5μL，注意加樣時(shí)槍頭要穿透穩(wěn)定液層加至反應(yīng)管大腔內(nèi)，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，移至反應(yīng)區(qū),,二、核酸擴(kuò)增,2、置65

12、℃恒溫反應(yīng)60min,,三、結(jié)果判斷,1、反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管倒置甩動2次，再正置甩動2次，使工作液與顯色液充分混合,,三、結(jié)果判斷,2、在陰性對照反應(yīng)管液體顏色為無色（或橙色），陽性對照反應(yīng)管液體顏色呈綠色的條件下： 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色呈綠色，則可報(bào)告該樣本檢測結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性； 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色為無色（或橙色），則可報(bào)告該樣本檢測結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陰性； 若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)

13、果無效，應(yīng)重新檢測。,,（1）LAMP結(jié)果為陽性，涂片結(jié)果也為陽性?？勺龀龌颊咭伤苹加薪Y(jié)核病的診斷，并開始抗結(jié)核治療，同時(shí)等待培養(yǎng)結(jié)果。（2）LAMP結(jié)果陽性，而涂片結(jié)果為陰性。根據(jù)臨床癥狀判斷是否開始抗結(jié)核治療，同時(shí)等待培養(yǎng)結(jié)果。這時(shí)可考慮增加一個(gè)或一個(gè)以上的標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測以確認(rèn)。如果增加的標(biāo)本檢測結(jié)果也為陽性，則患者可被初步診斷為患有結(jié)核病，并等待培養(yǎng)的結(jié)果。（3）LAMP結(jié)果為陰性，涂片結(jié)果為陽性。應(yīng)考慮LAMP結(jié)果是否