LAMP法在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)2009級(jí)碩士學(xué)位論文LAMP法在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究ThestudyonthedetectionofgeneticallymodifiedinfoodsusingLoop—mediatedisothermalamplification課題來源：國家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200910265)專業(yè)名稱學(xué)位申請(qǐng)人指導(dǎo)教師答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員生物化學(xué)與分子生物周琳華馬文麗教授均又聃教搜龐義教授黃樹林教授曹以誠教授程遠(yuǎn)雄

2、教授符立梧教授論文評(píng)閱人高國全教授胡志奇教授2012年5月15日廣州摘要擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD技術(shù))、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP技術(shù))、簡(jiǎn)單重復(fù)序列又稱微衛(wèi)星DNA技術(shù)(SimpleSequenceRepeat，SSR技術(shù))，和簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(InterSimpleSequen

3、ceRepeats，ISSR)等。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)是由Notomi等所屬的日本榮研株式會(huì)社于2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該技術(shù)的基本原理是針對(duì)待測(cè)基因靶序列的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(分別稱為上游內(nèi)部引物FIP、下游內(nèi)部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymera

4、se)在恒溫條件(65℃左右)保溫3060分鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的大量擴(kuò)增。其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、特異性高、成本低廉，故被廣大研究者認(rèn)為是可能替代PCR的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。本研究采用LAMP檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS4032、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米BTl76和轉(zhuǎn)基因水稻TT511四個(gè)品系的外源插入基因、內(nèi)源參照基因、品系特異性基因進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。研究?jī)?nèi)容主要分為三個(gè)部分：第一部分：查找相關(guān)文獻(xiàn)資料，以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40

5、32的外源插入基因CP4EPSPS為研究對(duì)象，摸索LAMP檢測(cè)技術(shù)反應(yīng)體系與相關(guān)參數(shù)。通過一系列實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論為：在25皿反應(yīng)體系中，1mmol／L甜菜堿，20mmol／LM礦5、081tL(即8U)BstDNA聚合酶、08mmol／LdNTPs、內(nèi)外引物濃度比為1／8加入去離子滅菌水補(bǔ)足體系，65。C恒溫度60min，LAMP反應(yīng)體系比較穩(wěn)定，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰。第二部分：針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GTS4032、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米