食品中轉基因成分的定量檢測研究.pdf

1、隨著轉基因作物在全世界范圍內的廣泛種植，其食用安全和環(huán)境安全問題一直受到廣大消費者和各國政府及相關機構人員的重視。很多國家和地區(qū)紛紛制定轉基因生物安全管理法規(guī)，實施標簽制度，并積極發(fā)展轉基因食品檢測監(jiān)測技術。轉基因食品檢測技術的廣泛應用導致陽性對照的需求量也在增加。傳統(tǒng)標準分子的構建通常是以轉基因材料與其對應的非轉基因材料按一定的質量比例配制而成，從而獲得一系列質量分數(shù)的標準品。然而，由于我國對轉基因標準品的嚴格控制，許多轉基因品系的標

2、準樣品很難得到。而包含有內源基因和外源基因以質粒形態(tài)存在的標準分子，具有穩(wěn)定性好、用量少、易保存、易獲得等優(yōu)點，因此，構建陽性質粒標準分子作為轉基因食品檢測的陽性對照材料已成為近幾年來的新型陽性材料研究的熱點。目前，食品中的轉基因成分檢測已從定性提高到定量水平，由于傳統(tǒng)定量PCR技術在到達擴增平臺期時才開始定量檢測，而不能消除每個靶基因擴增效率的差異產生的定量誤差，導致傳統(tǒng)定量PCR存在較大缺陷。理想條件下，每個循環(huán)PCR擴增的反應效率

3、一致，PCR反應后DNA濃度與最初的目標DNA量是成正比。然而，擴增效率在不同的反應之間，或在同一反應的不同循環(huán)中在不斷變化，特別是在PCR循環(huán)反應的后期，擴增產物以未知的反應速率呈非指數(shù)形式擴增。為使檢測的靈敏度達到最高，常規(guī)PCR大多采用終點定量法，此時擴增產物量達到最大（即“平臺期”）。但由于試劑的消耗以及聚合酶的逐漸失活，終產物的濃度和目標分子的初始濃度間的相互關系很難確定。近年來發(fā)展的實時熒光定量PCR技術是集PCR和探針雜交

4、技術優(yōu)點為一體，通過探測整個PCR過程中的熒光信號變化，準確定量DNA模板量，其檢測靈敏度比常規(guī)PCR技術高100倍左右，可檢測到每克樣品中含2pg轉基因DNA量，且對深加工產品和混合樣品都可進行定量檢測。相對于終點定量方法，實時熒光定量PCR反應體系可以隨反應的實際進程實時監(jiān)控整個反應變化。在實時熒光定量PCR中，PCR反應擴增產物的量和熒光信號的釋放聯(lián)系在一起，而且成一定比例，隨著每個循環(huán)中PCR擴增產物量的增加，熒光信號也會成比例

5、增加。記錄每個循環(huán)中釋放的熒光信號量，就可以監(jiān)控整個指數(shù)期中PCR擴增反應的情況。
　　 本文旨在研制幾種常見的轉基因作物的質粒標準分子并提供一套簡便、準確、高效的轉基因食品定量檢測技術體系，以解決陽性標準品的缺乏和深加工制品檢測繁瑣、可信度差等技術難題。這為我國主要糧食作物轉基因食品定量檢測標準化提供技術平臺，為建立完善的切實可行的深加工制品檢測體系及GMO標簽制度有效實施提供技術保證，同時為轉基因食品標識、環(huán)境安全與使用安全

6、的檢測及長期跟蹤監(jiān)測、監(jiān)控和安全隱患的預測、預警進而提供技術支撐。全文主要圍繞定量PCR檢測方法進行研究，參考我國最新國家標準、農業(yè)部公告、出入境檢驗檢疫行業(yè)標準和歐盟標準等收集轉基因材料，建立了5個主要物種13個品系的定量檢測方法，其中轉基因玉米(NK603、Bt11、59122、MON810、GA21、MIR604、MON863、TC1507、Bt176)品系9個，轉基因大豆(GTS40-3-2)，轉基因油菜(RT73)，轉基因大米

7、(TT51-1)，轉基因甜菜(H7-1)品系各一個，這些物種涵蓋了我國已批準和即將批準的主要進出口轉基因植物。檢測的靶序列包括內源基因和品系特異性序列共約20個常見基因序列。以標準樣品作為初期研究對象，驗證、優(yōu)化這些基因的最佳反應條件和反應體系，在獲得穩(wěn)定、準確、高效的檢測方法后，將之應用于轉基因植物種子、飼料、食品等初加工和深加工食品的檢測中。同時本文還構建了13個品系共9個新型質粒標準分子，并對其在實時熒光定量PCR檢測體系中的靈敏

8、度、穩(wěn)定性和精確性等指標做了進一步分析，建立了13個轉基因植物品系的定量PCR檢測方法，采用Taqman探針法對這些物種的品系特異性序列進行定量分析并有效地應用到初加工和深加工等食品的轉基因成分的檢測中。
　　 在質粒標準分子的研制中，本部分采用重疊延伸PCR成功構建了轉基因大豆、玉米、油菜、大米、甜菜5個常見物種13個品系的質粒標準分子，該技術與傳統(tǒng)的酶切連接方式不同，它不需要限制性內切酶和連接酶即可實現(xiàn)DNA片段的體外快速連

9、接。有研究者指出為了最大限度地避免堿基的錯配，重疊延伸PCR反應一般采用高保真DNA聚合酶，而本實驗中采用了非保真的Taq聚合酶來完成重疊延伸PCR，這種酶沒有3'→5'外切酶的活性，其擴增產物在3'端會自動添加堿基A，從本研究的實驗結果可以看出非保真酶擴增結果也很穩(wěn)定;同時，在實驗過程中采用高保真與非保真酶的對比進行重疊延伸PCR實驗，可以發(fā)現(xiàn)，連接片段在1000bp以內的這兩種酶擴增效率幾乎沒有實質差別。此外，對于重疊延伸PCR所需

10、引物的設計，本研究采用了兩種設計方式:第一種方式是在內源基因反向引物和外源基因正向引物基礎上添加與擴增引物無關的互補堿基序列，以這種方式獲得的重組DNA包含了中間連接的“額外”片段。第二種方式是在內源基因反向引物和外源基因正向引物基礎上添加與彼此互補的堿基序列，即添加在內源基因反向引物的接頭序列為外源基因正向引物的互補序列，添加在外源基因正向引物的接頭序列為內源基因反向引物的互補序列，以這種方式獲得的重組DNA片段為兩者擴增片段長度之和

11、而不會出現(xiàn)“額外”片段。實驗過程可發(fā)現(xiàn)第二種方式設計的引物重組DNA效果明顯優(yōu)于第一種方式。
　　 我們構建的標準分子為重組的質粒分子，其包含一段或多段外源插入基因及品系特異性序列，以及該物種已經鑒定的內源基因的部分特異性片段。根據轉基因生物檢測策略，設計相應的標準分子構建方案。目前品系特異性檢測方法因特異性最佳獲得了越來越廣泛的應用。本研究構建的質粒標準分子分別包含有內源基因及其品系特異性序列，其中pMD-1G、pMD-a5、

12、pMD-FR、pMD-sT和pMD-GH五個質粒含有一個品系特異性序列和一個內源基因序列，pMD-aNB、pMD-aMB、pMD-aGM和pMD-aMT四個質粒含有兩個品系特異性序列和一個內源基因序列。由于品系特異性序列是特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，為單拷貝序列，比基因組DNA標準品中其它外源基因的拷貝數(shù)更精確，因此品系特異性檢測方法具有很高的特異性和準確性，也更加適用于構建定量PCR檢測所需的標準曲線。
　　

13、在定量PCR檢測方法的研究中，為更好地評價建立的實時熒光定量PCR檢測體系的可行性，本研究對該檢測體系的靈敏度、穩(wěn)定性和精確性等指標做了進一步分析。選用20000copies/μl，2000copies/μl，200copies/μl，20copies/μl，2copies/μl五個濃度的標準溶液進行定量PCR的LOD和LOQ測定，得出其值分別為2copies和20copies;同時以轉基因大豆為例，測試質粒標準分子pMD-1G的穩(wěn)定性

14、能，它們的SD和RSD均屬正常范圍，說明標準分子可穩(wěn)定應用于定量PCR的檢測中;理想條件下，質粒標準分子中的不同基因擴增效率保持一致，即外源基因和內源基因的擴增拷貝數(shù)之比為100％，但在實際檢測中，其他因素常導致擴增效率不一致，本研究以1％質量分數(shù)的轉基因大豆標準樣品作為檢測對象，計算得出Cf值的平均值為0.94，其SD和RSD分別是0.11和11.57％，據此可以推斷pMD-1G質粒標準分子在定量PCR反應體系中的擴增幾乎同步。又以已

15、知5％、2％、1％、0.5％質量分數(shù)的標準樣品測試標準分子用于定量檢測的精確性，結果顯示實際測得的轉基因成分含量與真實值之間的差異隨樣品轉基因成分含量增高而增加，5％和2％樣品的檢測偏差(bias％)小于5％，樣品轉基因成分含量較低時檢測容易產生較大偏差。
　　 在全面評估質粒標準分子各項指標后，采用Taqman探針法構建了這13個品系的標準曲線，每組樣品的擴增效率（Eff％）在95.007％-118.438％正常范圍內，線性相

16、關系數(shù)(R2)≥0.990，同時每組樣品的三次平行實驗的重復性很高，這些證明了基于標準曲線用于定量檢測轉基因食品的可行性。此外，根據2692bp長的pMD-18T載體和13個品系基因組DNA的長度，我們將標準分子分別稀釋成2000000copies/μl,200000copies/μl,20000copies/μl,2000copies/μl,200copies/μl，20copies/μl六個梯度的標準溶液，由此建立的標準曲線能準確定