橡膠樹膠乳中性-堿性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆及其表達(dá)特性研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化酶(Invertase,Inv)催化蔗糖不可逆的裂解形成葡萄糖和果糖,是植物降解蔗糖和決定光合產(chǎn)物庫(kù)組織分配的關(guān)鍵酶。在橡膠樹中,橡膠生物合成是以蔗糖為原料,在乳管中進(jìn)行的。生理生化研究的證據(jù)已經(jīng)證實(shí):膠乳轉(zhuǎn)化酶定位于細(xì)胞質(zhì)胞液,最適酶活pH值為7.25-7.40,屬于中性/堿性轉(zhuǎn)化酶,是調(diào)控膠乳(橡膠)蔗糖代謝和影響橡膠產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。但是,在分子水平上對(duì)該酶的研究還相當(dāng)匱乏。因此,克隆中性/堿性轉(zhuǎn)化酶家族基因,了解其表達(dá)調(diào)控特點(diǎn),

2、并研究它們與乳管蔗糖降解以及與橡膠產(chǎn)量的關(guān)系具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
　　 本論文首次對(duì)巴西橡膠樹中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因進(jìn)行了克隆,并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析,并探討了這些基因可能的生物學(xué)功能。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)不同植物轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,利用RT-PCR和RACE技術(shù),從橡膠樹膠乳中克隆了兩個(gè)轉(zhuǎn)化酶基因的全長(zhǎng)cDNA,分別命名為HbNIN1和HbNIN2,序列已提交GenB

3、ank(GU573728和GU573727)。HbNIN1和HbNIN2均編碼577個(gè)氨基酸:生物信息學(xué)分析表明,這兩個(gè)基因的編碼蛋白均為中性/堿性轉(zhuǎn)化酶,含有植物中性/堿性轉(zhuǎn)化酶典型的十二個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示,HbNIN1很可能定位于胞液,而HbNIN2可能定位于胞液或葉綠體。
　　 2.克隆了HbNIN1和HbNIN2的基因組,序列分析顯示它們都包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子;構(gòu)建了HbNIN1和HbNIN2基因的原

4、核表達(dá)載體,并實(shí)現(xiàn)了在E.coli中的高效表達(dá);活性測(cè)定顯示,HbNIN2基因的原核表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的中性轉(zhuǎn)化酶活性,并且最適活性pH值在7.0左右,但未檢測(cè)到HbNIN1基因的原核表達(dá)產(chǎn)物具酶活性。
　　 3.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析,研究了兩個(gè)HbNIN基因的表達(dá)特性。在正常割膠橡膠樹不同組織(膠乳、樹皮和葉片)中的表達(dá)比較顯示,HbNIN1和HbNIN2均在膠乳中的表達(dá)量最高;在未開割樹中,傷害和割膠均可誘導(dǎo)HbNI

5、N2基因上調(diào)表達(dá),而下調(diào)HbNIN1基因的表達(dá),并且在第一次割膠的膠乳樣品中HbNIN1基因的表達(dá)豐度遠(yuǎn)高于HbNIN2基因,但隨割膠刀次的增加,HbNIN1基因的表達(dá)不斷下降,而HbNIN2基因的表達(dá)不斷增加,在產(chǎn)量穩(wěn)定的正常割膠樹中,兩個(gè)基因的表達(dá)豐度相近;在所測(cè)定的七種植物激素(或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)中,HbNIN2基因的表達(dá)顯著受甲基茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)誘導(dǎo);而HbNIN1被JA抑制、受SA誘導(dǎo),但受誘導(dǎo)的效

6、果不如HbNIN2明顯,乙烯利(ET)對(duì)HbNIN1和2兩個(gè)基因的表達(dá)均有誘導(dǎo)作用,但不如前面三種激素那么顯著;兩個(gè)基因在不同橡膠樹品系(熱研8-79、熱研7-33-97和PR107)間表達(dá)水平有差異,在PR107中最高,熱研8-79中其次,而在熱研7-33-97中最低;兩個(gè)基因在PR107品系不同產(chǎn)量單株間的表達(dá)存在明顯差異,并且表達(dá)水平與產(chǎn)量正相關(guān)。
　　 4.利用Genome Walking的方法獲得了巴西橡膠樹1373b

7、p的HbNIN2的5’調(diào)控序列,分析表明該序列中含有兩個(gè)真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域(414-464bp和1187bp-1237bp),同時(shí)該序列中還包含多種功能調(diào)控元件,且部分順式作用調(diào)控元件的功能已經(jīng)在HbNIN2基因表達(dá)分析中得到了驗(yàn)證。
　　 本文研究,首次獲得了兩個(gè)橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)化酶的編碼基因,并較為系統(tǒng)的研究了它們的表達(dá)調(diào)控特性。研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)轉(zhuǎn)化酶基因均編碼中性/堿性轉(zhuǎn)化酶,它們的表達(dá)受多種因素調(diào)控;在未開割的橡膠樹