靈芝羊毛甾醇合酶基因的克隆及其表達特性研究.pdf

1、靈芝（Ganoderma lucidum）在我國有著悠久的使用歷史，可用于調理和治療多種疾病。靈芝的主要藥效成分之一是三萜類化合物，具有抗腫瘤作用、抑制組織胺釋放作用、抗HIV和HIV蛋白酶及抑制膽固醇的合成和吸收等作用.所以，三萜類化合物的含量已成為評定靈芝藥用價值的重要指標。
　　 三萜作為次級代謝產物，是通過甲羥戊酸（MVA）途徑，經(jīng)過法呢酯焦磷酸、鯊烯、鯊烯-2，3-氧化物和羊毛甾醇等中間體，最后經(jīng)過一系列氧化還原以及環(huán)

2、化反應形成的。羊毛甾醇合酶（LS）處于甲羥戊酸（MVA）途徑中的第二個分支點，是萜類化合物合成過程中的一個關鍵酶，它可以催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化生成羊毛甾醇.LS的含量以及活性高低會影響到三萜類化合物的產量。
　　 根據(jù)已經(jīng)公布的其它物種LS蛋白質序列保守區(qū)，設計一對簡并引物，以靈芝基因組DNA作為模板，經(jīng)過簡并引物PCR擴增，一個488bp的靈芝LS基因特異DNA片段被得到。利用獲得的基因特異片段，設計三條特異的引物，采用SE

3、FAPCR方法，擴增獲得LS基因的5’端基因組DNA序列。以靈芝原基為材料制備cDNA，使用此cDNA作為模板，通過3'-RACE，得到了LS基因的3’端cDNA序列。根據(jù)PCR擴增得到的序列設計特異引物進行擴增，獲得了LS基因的全長cDNA序列。該序列長度為2181 bp，編碼726個氨基酸。根據(jù)獲得的序列信息進行拼接獲得了LS的全長基因組（genomic DNA）序列。該序列全長為2924 bp，LS基因由7個外顯子和6個內含子構成

4、。氨基酸序列經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，靈芝LS與擔子菌新型隱球菌Cryptococcusneoformans顯示出最高相似性（53％），這符合靈芝的經(jīng)典分類。將靈芝LS基因cDNA序列插入到酵母表達載體pYES2中，轉入由于缺失LS活性而依賴麥角甾醇（ergosterol）才能生存的酵母突變株osc△。結果顯示轉化子能夠在28℃、不添加麥角甾醇（ergosterol）的培養(yǎng)基上生長，而缺陷型單倍體不能生長，證實了所獲得的LS基因是有功能的。

5、根據(jù)靈芝LS基因組序列設計一對引物，以靈芝基因組DNA（genomic DNA）為模板，擴增得到了LS基因啟動子序列，此序列長度為767bp，用PlantCARE對LS啟動子序列進行預測，結果顯示LS基因啟動子中存在TATA-box和CAAT-box，同時還有多個響應光、激素ABA和環(huán)境壓力等因子的順式作用元件。
　　 通過real-time PCR的方法，對靈芝不同發(fā)育階段中LS的轉錄本差異進行了檢測。結果表明，在靈芝原基時期

6、，LS的轉錄本數(shù)量要顯著高于菌絲體中的轉錄本數(shù)量。這種規(guī)律與Hirotani等人所報道三萜含量的變化規(guī)律相同。在培養(yǎng)基中添加信號物質茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA），可以顯著地誘導靈芝三萜的合成。因此，用不同濃度MeJA處理菌絲體后對其中LS基因轉錄本進行了檢測。100-200μM MeJA作用下，LS基因的轉錄本顯示出連續(xù)性增加，最佳誘導濃度是200μM。同時，啟動子活性分析實驗表明在靈芝LS基因的啟動子中至少存