植物甾醇合成關(guān)鍵酶基因OsSQS遺傳轉(zhuǎn)化水稻的研究.pdf

1、植物甾醇(plant sterols)是植物細(xì)胞膜組成的必需成分之一，具有降膽固醇、抗癌、止咳等作用。在植物體內(nèi)，甾醇類(lèi)化合物是通過(guò)角鯊烯以不同方式環(huán)合形成的，角鯊烯則是由類(lèi)異戊二烯代謝途徑的產(chǎn)物法尼基二磷酸(FPP)在角鯊烯合成酶(SQS)的催化作用下合成的。因此，角鯊烯的合成是從類(lèi)異戊二烯代謝途徑進(jìn)入甾醇類(lèi)合成代謝的分支點(diǎn)，角鯊烯合成酶(SQS)則是甾醇類(lèi)合成代謝分支點(diǎn)的關(guān)鍵酶。本研究將含有角鯊烯合成酶基因(OsSQS)的雙T—DN

2、A植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化到稻谷產(chǎn)量高、甾醇含量較低的優(yōu)質(zhì)水稻品種“T—9”中，使其在水稻的胚乳中特異性高效表達(dá)，期望創(chuàng)建出稻谷產(chǎn)量高且甾醇含量較高的水稻品種。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1、目的基因克隆：采用PCR方法，從秈稻品種“IR30”中克隆出植物甾醇合成關(guān)鍵酶基因OsSQS的開(kāi)放閱讀框(1212bp)，編碼403個(gè)氨基酸。
　　 2、構(gòu)建含有OsSQS基因的雙T—DNA植物表達(dá)載體“pCDMAR—S

3、QS—hpt”：采用雙T—DNA共轉(zhuǎn)化的安全性轉(zhuǎn)基因策略，將選擇標(biāo)記基因hpt和OsSQS基因分別構(gòu)建在同一載體上兩個(gè)不同的T—DNA區(qū)，一個(gè)T—DNA區(qū)含有選擇標(biāo)記基因hpt，另一個(gè)T—DNA區(qū)則含有OsSQS基因，選用能使基因在水稻胚乳中特異性高效表達(dá)的pGt1為啟動(dòng)子，增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。
　　 3、轉(zhuǎn)OsSQS基因水稻的獲得：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將OsSQS基因?qū)雰?yōu)質(zhì)水稻品種“T—9”中，通過(guò)潮霉素抗性篩選，將抗性愈傷分

4、化成苗，共獲得203株潮霉素抗性植株。通過(guò)PCR檢測(cè)，共獲得含有OsSQS基因的植株25株。
　　 4、T0代轉(zhuǎn)基因種子β—谷甾醇含量測(cè)定：采用超聲波提取法，提取T0代轉(zhuǎn)基因種子中的β—谷甾醇，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)法，測(cè)其含量。結(jié)果顯示：在21個(gè)樣品中有16個(gè)樣品β—谷甾醇含量均高于陰性對(duì)照，其中最高的含量達(dá)到0．054％，陰性對(duì)照為0．027％。
　　 5、T1代無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的篩選：通過(guò)PCR檢測(cè)，篩選出含有目的基