河南株P(guān)PV的分離鑒定及VP2基因的克隆與序列分析.pdf

1、豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒引起的以初產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔為特征的繁殖障礙性疾病。該病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)豬場(chǎng)流行，嚴(yán)重地影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，因此一直是豬病研究的熱點(diǎn)之一。本研究首先建立了用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒感染的PCR方法，并使用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在臨床病料中分離了一株豬細(xì)小病毒，在此基礎(chǔ)上利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了豬細(xì)小病毒的VP2基因主要抗原決定區(qū)序列并與其他國(guó)內(nèi)外13個(gè)細(xì)小病毒基因組進(jìn)行了比較和分析，為下

2、一步進(jìn)行原核表達(dá)、真核表達(dá)以及基因工程疫苗免疫預(yù)防應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 根據(jù)已報(bào)道的豬細(xì)小病毒基因組序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)寡核苷酸引物，通過PCR擴(kuò)增成功地從豬細(xì)小病毒感染的胎兒和細(xì)胞中擴(kuò)增出1124bp片段，回收該片段用HindⅢ酶切得到了預(yù)期的結(jié)果，以PPV細(xì)胞毒、PCV2、PRRSV、PRV及臨床病料為模板，結(jié)果只有PPV細(xì)胞毒和部分疑似病料擴(kuò)增出目的條帶。將PPVRFDNA模板進(jìn)行10-6稀釋后依然可以檢出說明該方法敏感性很

3、好。利用該方法對(duì)臨床上32份流產(chǎn)病料的檢測(cè)，檢出陽性6份，而同時(shí)利用HA檢測(cè)陽性只有4份。這些結(jié)果說明本研究建立的PCR診斷方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。利用本方法檢測(cè)到的陽性病料進(jìn)行初步分離鑒定，發(fā)現(xiàn)該分離病毒在PK-15細(xì)胞上連續(xù)盲傳4代，可致PK-15細(xì)胞出現(xiàn)聚堆、拉網(wǎng)、形成空斑等典型病變；瓊擴(kuò)試驗(yàn)可見明顯的沉淀線；間接免疫熒光陽性；應(yīng)用本課題已建立的豬細(xì)小病毒的PCR診斷方法，以提取的病毒DNA作為模板，擴(kuò)增出特異性的目的片

4、段。上述結(jié)果證明，所分離到的病毒為豬細(xì)小病毒，并將其暫命名為PPVZK株。 PCR反應(yīng)擴(kuò)增了包含豬細(xì)小病毒VP2主要抗原表位基因DNA片段，并進(jìn)行了克隆和測(cè)序，將該序列在GenBank上利用DNABlast軟件和DNAstar軟件和其他國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該株病毒與GenBank登錄的PPV-VP2基因組的核苷酸和氨基酸同源性均達(dá)到97％以上，證明了PPVVP2基因序列是十分保守的，但從序列進(jìn)化樹上仍可以看出地域差異，與大

5、部分國(guó)內(nèi)序列在一個(gè)分支上而與德國(guó)分離株關(guān)系較遠(yuǎn)。氨基酸序列分析結(jié)果表明該片段編碼352個(gè)氨基酸，具有14個(gè)潛在的抗原位點(diǎn)均勻分布，而且疏水性區(qū)域和親水性區(qū)域分布也都比較均勻，這一結(jié)果預(yù)示著PPV-ZK株VP2基因可以應(yīng)用于免疫預(yù)防的良好前景。 本研究中PPVPCR檢測(cè)方法的建立解決了PPV隱性感染和早期感染以及傳代細(xì)胞系污染不易檢測(cè)的難題，對(duì)豬細(xì)小病毒病的臨床診斷、控制以及生物制品的生產(chǎn)等均具有重要意義。對(duì)VP2結(jié)構(gòu)蛋白基因的克