山東部分地區(qū)水貂細(xì)小病毒病的確診、VP2基因的克隆測(cè)序和分析及病毒分離鑒定.pdf

1、水貂細(xì)小病毒(Mink enteritis virus，MEV)在分類上屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，已在全世界多個(gè)國(guó)家迅速傳播和蔓延，是目前公認(rèn)的引起水貂病毒性腸炎和心肌炎的重大病原之一。水貂病毒性腸炎是一種急性、高度致死性傳染病，具有感染率高、發(fā)病急、病程短、發(fā)病率高的特點(diǎn)。VP2蛋白是水貂細(xì)小病毒的主要衣殼蛋白，對(duì)病毒的宿主范圍、組織嗜性、抗原性、血凝性等起重要作用。該蛋白中幾個(gè)甚

2、至一個(gè)氨基酸的突變都可能導(dǎo)致整個(gè)病毒的抗原性發(fā)生改變，因此對(duì)VP2基因的研究至關(guān)重要。本研究主要對(duì)在山東部分地區(qū)的水貂細(xì)小病毒病進(jìn)行確診，對(duì)水貂細(xì)小病毒進(jìn)行分離鑒定，系統(tǒng)地分析VP2基因的變異情況，探索山東部分地區(qū)水貂細(xì)小病毒的流行趨勢(shì)及分子基礎(chǔ)，為該病的預(yù)防以及相關(guān)疫苗的研制打下基礎(chǔ)。本文主要從以下三方面展開了相關(guān)研究：
　　試驗(yàn)一山東部分地區(qū)水貂細(xì)小病毒病的確診
　　從山東濰坊、煙臺(tái)、威海、青島地區(qū)的水貂養(yǎng)殖廠收集樣本，

3、病貂出現(xiàn)血便、消瘦、發(fā)燒等癥狀，病理變化出現(xiàn)腸道出血，內(nèi)容物呈現(xiàn)煤焦油狀，糞便呈現(xiàn)血紅色等現(xiàn)象為疑似病料，用膠體金試紙條檢測(cè)，若為陽(yáng)性，則用 PCR進(jìn)一步確診，對(duì)這些確診病料收集并記錄，為后續(xù)的VP2的測(cè)序分析和病毒的分離鑒定試驗(yàn)打好基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)二山東部分地區(qū)水貂細(xì)小病毒VP2基因的克隆測(cè)序和分析
　　根據(jù)GenBank發(fā)表的MEV VP2基因序列用分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品擴(kuò)增其VP2基因，將

4、其與GenBank上公布的4株國(guó)內(nèi)外MEV VP2基因、10株國(guó)內(nèi)外的CPV-2a型的VP2基因、10株國(guó)內(nèi)外的CPV-2b型VP2基因、1株國(guó)內(nèi)的CPV-2c型VP2基因和8份國(guó)內(nèi)外FPV VP2基因進(jìn)行了相關(guān)比較,VP2基因的核苷酸序列同源性為97.6％-99.8%，氨基酸序列同源性為91.8%-99.7%。發(fā)育進(jìn)化樹表明各毒株的親緣關(guān)系雖然較近，但也發(fā)生了一定的變異，不同毒株主要在87、101、267、297、300、324、42

5、6、440和555位氨基酸發(fā)生了替換。
　　試驗(yàn)三山東部分地區(qū)水貂細(xì)小病毒的分離鑒定
　　將處理好的陽(yáng)性病料上清液接種于 F81細(xì)胞，進(jìn)行盲傳，盲傳5代后出現(xiàn)明顯的CPE，在接種后第5d出現(xiàn)80%以上病變時(shí)收毒，通過(guò)血凝血凝抑制試驗(yàn)（HA和HI）和PCR鑒定該分離病毒，結(jié)果表明該病毒能與CPV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清產(chǎn)生凝集抑制；PCR測(cè)序結(jié)果和GenBank上的公布的MEV NS基因參考序列同源率高達(dá)98.5%；同時(shí)測(cè)定其TCID50