HBsAg和B19 VP2復(fù)合抗原的基因克隆及表達(dá).pdf

1、背景與目的： 人微小病毒B19(HumanParvovirusB19)是微小病毒科微小病毒屬中目前已知的唯一使人類致病的病毒，也是動(dòng)物病毒中體積最小結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的DNA病毒。主要經(jīng)呼吸道和血液途徑傳播，可引起社區(qū)局部流行。自1990年首次證實(shí)我國(guó)存在該病毒后，陸續(xù)報(bào)告B19病毒感染是我國(guó)孕婦非免疫性流產(chǎn)、兒童急性再障危象、急性血小板減少性紫癜等疾病的重要病因之一?，F(xiàn)己證實(shí)該病毒同多種兒童及成人疾病有關(guān)。同時(shí)，我國(guó)婦女和兒童血清中保

2、護(hù)性抗體水平低，易發(fā)生該病毒感染。尤其免疫功能低下或缺陷患者可發(fā)生持續(xù)感染和慢性貧血，危及生命。且隨著檢測(cè)手段的改進(jìn)及研究的深入，其疾病譜還在不斷擴(kuò)大。B19病毒基因組長(zhǎng)約5．6kb，編碼兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VPl和VP2)及一個(gè)主要的非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)。B19病毒衣殼蛋白主要由VP2蛋白組成，VPl蛋白不超過(guò)衣殼蛋白的10％，其獨(dú)特區(qū)暴露在病毒的表面。B19病毒感染引起的機(jī)體免疫反應(yīng)主要是針對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2，而VPl除在其氨基端

3、有一227個(gè)氨基酸的獨(dú)特區(qū)外，其余與VP2相同。乙型肝炎病毒(HBV)的感染在人群中比例很高，且感染后體內(nèi)能形成的主要保護(hù)性抗體為針對(duì)表面抗原(HBsAg)的表面抗體(抗一HBs)。本課題的目的是選擇B19一VP2抗原基因和HBsAg基因重組，利用pGEX一5X-1原核表達(dá)載體表達(dá)，從而建立表達(dá)B19和HBV復(fù)合抗原系統(tǒng)，并檢測(cè)此復(fù)合抗原的抗原性，給HBV和B19病毒重組多價(jià)疫苗的研制和復(fù)合診斷試劑提供抗原。 方法： 根

4、據(jù)GenBank收錄的HBV及B19病毒序列，設(shè)計(jì)PCR引物，并在每條引物前分別加入一定的內(nèi)切酶位點(diǎn)。利用PCR和分子克隆技術(shù)，從含HBV病毒全基因的重組質(zhì)粒pUCl8一HBV和含B19病毒全基因的重組質(zhì)粒pGEMl一B19分別擴(kuò)增出乙肝表面抗原(HBsAg)基因及B19病毒VP2基因；將其分別與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化入JMl09大腸桿菌中，利用氨芐青霉素抗性、藍(lán)白篩選篩選出陽(yáng)性克隆，并以PCR等方法對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)行鑒定，從而構(gòu)建出pG

5、EM-T-HBs及pGEM-T—VP2并測(cè)序分析；測(cè)序證實(shí)序列正確后，將pGEM-T-HBs中的HBs基因與pGEX-5X一1表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)化入JMl09大腸桿菌，利用PCR方法鑒定得到pGEX-5X-i-HBs；再將pGEM—T-VP2中的VP2基因連接入pGEX一5X-1-HBs中，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)宿主菌中，用PCR擴(kuò)增等方法篩選出陽(yáng)性克隆pGEX-5X-1-HBs—VP2并測(cè)序：以IPTG誘導(dǎo)含pGEX一5X一卜HB

6、s-VP2的宿主菌表達(dá)融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況，并用Western-blot鑒定融合蛋白的抗原性。 結(jié)果： 1．靶基因擴(kuò)增：以含有B19病毒全基因的質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增得到VP2目的基因(3304-4968)，加上兩端內(nèi)切酶位點(diǎn)共1680個(gè)堿基對(duì)；以含有HBV全基因的質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增得到HBsAg的目的基因(155—835)，加上兩端酶切位點(diǎn)共694個(gè)堿基對(duì)。 2．成功

7、構(gòu)建pGEM-T-HBs及pGEM-T-VP2原核重組質(zhì)粒，HBs及VP2基因的測(cè)序結(jié)果均與GenBank公布的一致。 3．成功構(gòu)建pGEX一5X-1-HBs-VP2，并經(jīng)SDS—PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明，含pGEX一5X一卜HBs-VP2的BL21(DE3)宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能表達(dá)出目的融合蛋白，分子量大小與預(yù)期的一致(111KD)。 4．Western—blot檢測(cè)結(jié)果顯示該融合蛋白均可與抗一HBs和抗一VP