抗傳染性法氏囊病毒單抗的制備和VP2基因的序列分析.pdf

1、為了獲得抗傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的單克隆抗體，并對單抗進(jìn)行分析鑒定，為傳染性法氏囊病的診斷以及其抗原表位等研究提供依據(jù)。研究用傳染性法氏囊病毒B87株和原核表達(dá)病毒VP2蛋白分別免疫小鼠制備單抗，然后對制備單抗進(jìn)行鑒定與分析。具體如下：
　　 首先，通過IBDV B87株在雞胚尿囊腔的增殖后采用超速離心法濃縮IBDV。將IBDV與弗氏佐劑乳化后免疫Balb/c

2、小鼠，取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，以IBDV包被建立間接ELISA方法篩選出了四株抗IBDV的細(xì)胞株，命名為I8，I13，I25，I86。陽性細(xì)胞經(jīng)過亞克隆純化后擴(kuò)大培養(yǎng)，體外制備單抗腹水，并對單抗腹水的ELISA效價，特異性，亞型，針對抗原表位等方面進(jìn)行分析。間接ELISA結(jié)果表明，I8，I13，I25，I86分泌單抗效價分別為1：6×104，1：1×1o5，1：2×106，1：6×104，I25分泌單抗

3、的ELISA效價相對較高。亞型分析表明，I8，I13，I25的亞型為IgG2b，I86亞型為IgGl。特異性試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，單抗腹水只與IBDV發(fā)生反應(yīng)而不與新城疫病毒(Newcastle disease virus， NDV)，雞胚尿囊液等發(fā)生反應(yīng)，具有較好的特異性。相加ELSIA結(jié)果表明，I8與I13單抗針對的抗原表位相近，I8(I13)、I25、I86單抗間針對的抗原位點(diǎn)各不相同。用原核表達(dá)IBDV的VP2蛋白包被ELISA板，用I

4、8，I13，I25，I86與其進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)，單抗腹水經(jīng)200倍稀釋后均能與VP2蛋白反應(yīng)，而陰性腹水不反應(yīng)，表明IBDV免疫制備的單抗能特異性的識別IBDV的VP2蛋白。
　　 擴(kuò)增IBDV B87株VP2基因的保守區(qū)域，將其克隆到原核表達(dá)載體PET-32a和PGEX4T-1上，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR，雙酶切，測序鑒定后，對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過對誘導(dǎo)劑濃度，誘導(dǎo)時間，蛋白表達(dá)的可溶性分析等條件的優(yōu)化摸索，大量表達(dá)了重組V

5、P2蛋白。用NI純化樹脂對HIS-VP2蛋白進(jìn)行純化。并對重組蛋白的濃度，純度以及免疫活性等進(jìn)行檢測。用HIS-VP2蛋白免疫小鼠，取免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，分別用HIS-VP2和GST-VP2蛋白包被建立間接ELISA篩選方法對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，通過連續(xù)亞克隆最終獲得了兩株陽性細(xì)胞株，命名為V1，V38。通過體外方法制備單抗腹水，對單抗腹水的ELSIA效價，特異性，穩(wěn)定性，抗原性等進(jìn)行初步鑒定。SDS-PAGE結(jié)果顯示，原核表達(dá)V

6、P2蛋白具有很高的表達(dá)量，且以包涵體形式表達(dá)。純化后HIS-VP2蛋白濃度達(dá)2.62mg/mL且純度較高，能與IBDV免疫的多抗反應(yīng)，具有抗原性。單抗鑒定結(jié)果表明，V1，V38單抗腹水的效價達(dá)到1：104以上，且V1，V38的單抗腹水針對的抗原表位不同，但均能與IBDV發(fā)生ELISA反應(yīng)，具有較高的特異性和穩(wěn)定性。
　　 為了探究安徽地區(qū)IBDV基因是否發(fā)生了變異及變異的程度，以便更好地為本地區(qū)IBD的防制工作提供依據(jù)。試驗(yàn)根據(jù)

7、GenBank上已經(jīng)發(fā)表的IBDV的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了一對特異性的擴(kuò)增IBDV VP2高變區(qū)基因的引物，以臨床上用IBDV金膠條快速診斷試紙確診為IBDV的安徽株(分別命名為AH-1、AH-2、AH-7、AH-9)基因組為模版，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出長約567bp的VP2高變區(qū)基因片段，將其連接到PMD18-T載體上。經(jīng)PCR鑒定及核苷酸序列測定證實(shí)，成功獲得4個安徽分離株VP2高變區(qū)基因的重組質(zhì)粒。將四株VP2高變區(qū)核苷酸序

8、列及推導(dǎo)出的氨基酸序列與GenBank中公布的11株IBDV相應(yīng)序列應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同源性比較和進(jìn)化樹分析表明，IBDV安徽株分為兩類，AH-2，AH-9與CU-1，B87，NB，D78，STC同屬于一個分支，親緣關(guān)系較近；而AH-1，AH-7與OKYM，HK46，G9201，UK661屬于一個分支，親緣關(guān)系較近。對IBDV安徽株VP2高變區(qū)氨基酸進(jìn)行抗原性和毒力的分析表明目前安徽流行毒株在抗原上未發(fā)生質(zhì)