抗傳染性法氏囊病毒單抗的制備和VP2基因的序列分析.pdf

1、為了獲得抗傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的單克隆抗體，并對單抗進行分析鑒定，為傳染性法氏囊病的診斷以及其抗原表位等研究提供依據。研究用傳染性法氏囊病毒B87株和原核表達病毒VP2蛋白分別免疫小鼠制備單抗，然后對制備單抗進行鑒定與分析。具體如下：
　　 首先，通過IBDV B87株在雞胚尿囊腔的增殖后采用超速離心法濃縮IBDV。將IBDV與弗氏佐劑乳化后免疫Balb/c

2、小鼠，取免疫鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0用PEG進行細胞融合，以IBDV包被建立間接ELISA方法篩選出了四株抗IBDV的細胞株，命名為I8，I13，I25，I86。陽性細胞經過亞克隆純化后擴大培養(yǎng)，體外制備單抗腹水，并對單抗腹水的ELISA效價，特異性，亞型，針對抗原表位等方面進行分析。間接ELISA結果表明，I8，I13，I25，I86分泌單抗效價分別為1：6×104，1：1×1o5，1：2×106，1：6×104，I25分泌單抗

3、的ELISA效價相對較高。亞型分析表明，I8，I13，I25的亞型為IgG2b，I86亞型為IgGl。特異性試驗結果證實，單抗腹水只與IBDV發(fā)生反應而不與新城疫病毒(Newcastle disease virus， NDV)，雞胚尿囊液等發(fā)生反應，具有較好的特異性。相加ELSIA結果表明，I8與I13單抗針對的抗原表位相近，I8(I13)、I25、I86單抗間針對的抗原位點各不相同。用原核表達IBDV的VP2蛋白包被ELISA板，用I

4、8，I13，I25，I86與其進行間接ELISA反應，單抗腹水經200倍稀釋后均能與VP2蛋白反應，而陰性腹水不反應，表明IBDV免疫制備的單抗能特異性的識別IBDV的VP2蛋白。
　　 擴增IBDV B87株VP2基因的保守區(qū)域，將其克隆到原核表達載體PET-32a和PGEX4T-1上，對重組質粒進行PCR，雙酶切，測序鑒定后，對其進行誘導表達，通過對誘導劑濃度，誘導時間，蛋白表達的可溶性分析等條件的優(yōu)化摸索，大量表達了重組V

5、P2蛋白。用NI純化樹脂對HIS-VP2蛋白進行純化。并對重組蛋白的濃度，純度以及免疫活性等進行檢測。用HIS-VP2蛋白免疫小鼠，取免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合，分別用HIS-VP2和GST-VP2蛋白包被建立間接ELISA篩選方法對融合細胞進行篩選，通過連續(xù)亞克隆最終獲得了兩株陽性細胞株，命名為V1，V38。通過體外方法制備單抗腹水，對單抗腹水的ELSIA效價，特異性，穩(wěn)定性，抗原性等進行初步鑒定。SDS-PAGE結果顯示，原核表達V

6、P2蛋白具有很高的表達量，且以包涵體形式表達。純化后HIS-VP2蛋白濃度達2.62mg/mL且純度較高，能與IBDV免疫的多抗反應，具有抗原性。單抗鑒定結果表明，V1，V38單抗腹水的效價達到1：104以上，且V1，V38的單抗腹水針對的抗原表位不同，但均能與IBDV發(fā)生ELISA反應，具有較高的特異性和穩(wěn)定性。
　　 為了探究安徽地區(qū)IBDV基因是否發(fā)生了變異及變異的程度，以便更好地為本地區(qū)IBD的防制工作提供依據。試驗根據

7、GenBank上已經發(fā)表的IBDV的核苷酸序列，設計并合成了一對特異性的擴增IBDV VP2高變區(qū)基因的引物，以臨床上用IBDV金膠條快速診斷試紙確診為IBDV的安徽株(分別命名為AH-1、AH-2、AH-7、AH-9)基因組為模版，利用RT-PCR技術擴增出長約567bp的VP2高變區(qū)基因片段，將其連接到PMD18-T載體上。經PCR鑒定及核苷酸序列測定證實，成功獲得4個安徽分離株VP2高變區(qū)基因的重組質粒。將四株VP2高變區(qū)核苷酸序

8、列及推導出的氨基酸序列與GenBank中公布的11株IBDV相應序列應用生物學軟件進行同源性比較，并構建系統(tǒng)進化樹。同源性比較和進化樹分析表明，IBDV安徽株分為兩類，AH-2，AH-9與CU-1，B87，NB，D78，STC同屬于一個分支，親緣關系較近；而AH-1，AH-7與OKYM，HK46，G9201，UK661屬于一個分支，親緣關系較近。對IBDV安徽株VP2高變區(qū)氨基酸進行抗原性和毒力的分析表明目前安徽流行毒株在抗原上未發(fā)生質