組成型表達雞傳染性法氏囊病毒vp2基因重組乳酸菌的構建及免疫原性分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引發(fā)的一種雞的免疫抑制性傳染病，該病給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失。本研究中，利用乳酸菌表達載體pPG612構建了表達IBDV免疫原性蛋白vp2的重組表達質粒，并分別在L.plantarum，L.pentoses，和L.casei393三株乳酸菌中進行表達。pPG612載體是一種表面展示載體，該載體中包含HCE組成型啟動子和PgsA錨定蛋白，同時為了提高vp2蛋白的表達量，本研究在該

2、載體中插入了T7g10增強子。本研究對高效制備表達vp2蛋白的陽性重組乳酸菌策略進行了改善，主要評價指標如下:OD600值處于0.4-0.5，重組質粒含量為2μl-6μl（100ng/μl），電壓為2.3-2.4 kv/cm。結果顯示，有兩種重組質粒在三種乳酸菌中均表現(xiàn)出高電轉化率，即(i) pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2，(ii) pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2，之后的酶

3、切鑒定和PCR鑒定也都均證實了該結果。該方法較之前使用的構建重組乳酸菌的方法更加簡單且更加高效。
　　本研究還分別對三株含有pPG612-vp2(pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1 T2)和pPG612-T7g10-vp2（pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2）重組質粒的重組乳酸菌作為口服疫苗的免疫原性和針對IBDV的保護率進行了評價。實驗結果顯示，vp2蛋白成功的獲得了表達并展示

4、在各重組乳酸菌的表面，將這些重組乳酸分別命名如下，LPL/pPG612-vp2(PL)，LPL/pPG612-T7g10-vp2(TL)，LPE/pPG612-vp2(PE), LPE/pPG612-T7g10-vp2(TE),LC/pPG612-vp2(PC)和LC/pPG612-T7g10-vp2(TC)。其中，含有pPG612-T7g10-vp2質粒的重組菌的vp2蛋白表達量較高，說明T7g10增強子能夠有效提高vp2蛋白在乳酸菌

5、中的表達水平。動物實驗結果顯示，口服免疫后，LPL/pPG612-T7g10-vp2株乳酸菌能夠刺激機體產生更強的免疫反應以及更高的免疫保護率(87.5％)。通過本研究可以證明，重組乳酸菌系統(tǒng)作為口服疫苗可以刺激動物產生較強的抗體水平， pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1 T2免疫組產生的抗體水平顯著高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫組，并且L.plantarum菌株免疫組的免

6、疫保護率高于L.casei免疫組和L.pentoses免疫組。同時，L.casei免疫組的保護率高于L.pentoses免疫組。
　　動物實驗中，在vp2免疫組中檢測到大量的T細胞，在IBDV攻毒組中也檢測到數(shù)量增多。與空白對照組相比，所有免疫組的CD4+和CD8+T細胞均顯著性增高，其中pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫組的CD4+和CD8+T細胞比例高于pPG612-HCE-PgsA-vp

7、2-rrnBT1T2免疫組。TL免疫組中CD8+T細胞和CD4+T細胞的分化率分別為13.3％和21.0％，高于PL免疫組的10.4％和14.0％; TC免疫組CD8+T細胞和CD4+T細胞的分化率分別為11.4％和20.9％，高于PC免疫組的7.2％和11.5％; TE免疫組CD8+T細胞和CD4+T細胞的分化率分別為8.3％和16.7％，高于PE組的7.5％和13.5％。所有免疫組的CD8+T細胞分化率均高于CD4+T細胞。CD8+

8、T細胞屬于細胞毒性T細胞，可以裂解感染病毒的細胞、腫瘤細胞和同種異體移植物，在免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用。在細胞免疫反應的檢測結果中，重組L.plantarum菌株免疫組的CD8+T細胞和CD4+T細胞的分化率高于重組L.casei菌株組和重組L.pentoses菌株組。pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫組產生的IFN-γ，IL-2和IL-4細胞因子水平高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rr

9、nBT1T2免疫組;其它數(shù)據(jù)顯示，IFN-γ水平高于IL-2水平，IL-2水平高于IL-4水平;重組L.plantarum菌株免疫組較其他兩個重組菌免疫組能夠刺激產生更高水平的Th1和Th2型細胞因子，并且重組L.casei菌株免疫組刺激產生Th1和Th2型細胞因子水平高于重組L.pentoses菌株免疫組。IFN-γ和IL-2等Th1型細胞因子和細胞免疫相關，IL-4等Th2型細胞因子和體液免疫相關。本研究得出結論，含有pPG612-