豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)所引起的,以急性腸炎和水瀉為特征的腸道傳染病,對哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重,死亡率在95％以上,該病在世界范圍內(nèi)流行,給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。腸道黏膜免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的分泌型抗體(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗體。因此,研制一種能夠有效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答和全身免疫反應(yīng)的疫苗,對防治PED具有重要意義。
　　 PEDV S基因的保護性抗原基因(COE基因,499

2、～638aa)是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的主要基因,此外,S1蛋白S1D(636～789aa)區(qū)包含了一個線性抗原表位(697～742aa)和兩個B細(xì)胞表位(744～759aa和756～771aa),兩者都是優(yōu)秀的疫苗候選抗原。減毒沙門氏菌作為疫苗載體具有可以有效遞呈抗原,激發(fā)誘導(dǎo)抗沙門氏菌和外源抗原的全身免疫和黏膜免疫的優(yōu)點。
　　 本研究以減毒豬霍亂沙門氏菌△asd C500缺失株(命名為C501)作為呈遞抗原的活菌載體,以PE

3、DV COE基因和SD基因為靶基因,分別構(gòu)建重組減毒沙門氏菌,并測定其的免疫原性,以期得到一種預(yù)防豬流行性腹瀉的基因工程活疫苗。主要研究內(nèi)容包括:
　　 1重組豬霍亂減毒沙門氏菌的構(gòu)建及鑒定
　　 參考已經(jīng)發(fā)布的PEDV CV777株(Genebank NO.AF353511),設(shè)計特異性引物。利用PCR技術(shù),從陽性病料中擴增出約480bp的COE基因和462 bp的SD基因,序列比對結(jié)果表明,COE基因和SD基因序列與

4、CV777株相應(yīng)序列同源性均高達(dá)97％,且與其它已發(fā)布的不同PEDV毒株的基因序列同源性也均在91％以上。將擴增得到得的目的基因克隆到無抗性表達(dá)質(zhì)粒pYA3493中,構(gòu)建無抗性原核質(zhì)粒pYA-COE和pYA-SD,然后將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒豬霍亂沙門氏菌△asd C500缺失株中,構(gòu)建重組減毒沙門氏菌菌株C501-COE和C501-SD,并經(jīng)PCR和測序鑒定,測序結(jié)果顯示該重組菌中的外源片段序列無突變和移碼,顯示構(gòu)建成功。
　　

5、2重組菌的生物學(xué)特性研究
　　 本研究對構(gòu)建的重組沙門氏菌進行了生物學(xué)特性鑒定(分泌表達(dá)、生長特性、表型特征及遺傳穩(wěn)定性)。重組菌中蛋白的表達(dá)及表達(dá)蛋白的定位通過Westernblotting和間接免疫熒光進行鑒定,Western blotting結(jié)果顯示該重組菌可在17.8 kD和17kD處檢測到特異性的反應(yīng)條帶,且間接免疫熒光實驗結(jié)果顯示重組菌中所表達(dá)的外源蛋白主要定位于菌體表面。目的蛋白在減毒沙門氏菌菌體表面得到表達(dá)的同時

6、并未影響沙門氏菌自身的生長特性,親本菌株和重組菌在37℃恒溫培養(yǎng)11 h以后,其OD600均可達(dá)到1.0左右；經(jīng)表型鑒定和傳代培養(yǎng)試驗鑒定得知,該重組菌不僅保留了與親本菌株C500相同的生化特性,重組菌在經(jīng)過連續(xù)50代傳代以后仍可從重組菌中擴增到目的基因,且測序結(jié)果也顯示了目的基因未發(fā)生任何突變。
　　 3重組菌對小鼠的免疫效力研究
　　 為評價重組菌C501-COE和C501-SD作為PED新型重組疫苗的免疫效力,本實

7、驗將1.5×108CFU/只的劑量,分別以口服和肌肉注射的方式免疫接種BALB/c小鼠,利用間接ELISA的方法和SYBR定量PCR的方法檢測各種免疫學(xué)指標(biāo),實驗結(jié)果如下:①sIgA產(chǎn)生情況,重組菌C501-COE和C501-SD口服免疫組sIgA抗體滴度分別為1:1280和1:2048,而肌肉注射組的sIgA抗體滴度分別為1:640和1:1024；②血清IgG抗體產(chǎn)生情況,重組菌C501-COE和C501-SD肌肉注射組中的IgG抗體

8、滴度分別為1:4096和1:2560,而口服免疫組所產(chǎn)生的IgG抗體滴度分別為1:2048和1:1280:③由體外刺激脾淋巴細(xì)胞時所產(chǎn)生的IFN-γ水平來看兩個重組菌的肌肉注射組也明顯高于口服免疫組。以上結(jié)果充分顯示兩種不同免疫方法免疫重組菌時均可誘導(dǎo)一定程度的黏膜免疫和體液免疫,同時也能誘導(dǎo)一定水平的細(xì)胞免疫反應(yīng),但是口服免疫時可以誘導(dǎo)更高水平的黏膜免疫。
　　 4重組菌的初步臨床效果觀察
　　 將3×109CFU劑量