表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中和抗原區(qū)重組乳酸乳球菌系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是冠狀病毒家庭成員。豬流行性腹瀉病毒感染豬的腸道上皮細(xì)胞而引起嚴(yán)重腹瀉，尤其對(duì)于仔豬，感染后死亡率幾乎為100％。該病是以發(fā)病豬嘔吐、腹瀉、嚴(yán)重脫水為臨床特征的高度接觸性腸道傳染病。在世界范圍內(nèi)分布，呈地方流行性，尤其在東亞各國(guó)流行更為廣泛，是各養(yǎng)豬國(guó)家導(dǎo)致仔豬早期死亡的重要疫病之一。
　　 針對(duì)豬流行性腹瀉病毒經(jīng)黏膜感染的特點(diǎn)，研制能有

2、效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答，進(jìn)一步引起全身性系統(tǒng)免疫反應(yīng)的疫苗，對(duì)該病的防治具有重要意義。
　　 本研究以乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000作為遞呈抗原的活菌載體，以豬流行性腹瀉病毒免疫保護(hù)性抗原S蛋白部分基因片段ps420（499-638aa）為靶基因，構(gòu)建了表達(dá)豬流行性腹瀉病毒ps420基因的重組乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)。
　　 以含有豬流行性腹瀉病毒ps420基因的質(zhì)粒pPG612.1

3、-ps420為模板，PCR擴(kuò)增出約420bp的目的基因ps420，并克隆到pMD18-T simple載體，進(jìn)行酶切、PCR鑒定，重組質(zhì)粒命名為pMD18-TS-ps420。重組質(zhì)粒與表達(dá)載體均經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收目的基因片段ps420與表達(dá)載體pNZ8112連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)NZ9000，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命名pNZ8112-ps420，重組乳酸乳球菌pNZ8112-ps420/NZ9000。

4、>　　 重組菌pNZ8112-ps420在GM17（含氯霉素）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)Nisin誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。重組菌中蛋白的表達(dá)及表達(dá)蛋白的定位通過(guò)SDS-PAGE、Western blotting和間接免疫熒光進(jìn)行鑒定。考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示：pNZ8112-ps420的菌體裂解物表達(dá)了15KD的融合蛋白，誘導(dǎo)后表達(dá)的ps420蛋白經(jīng)Western-blot分析，可檢測(cè)到特異性反應(yīng)條帶。
　　 將重組菌免疫接種家兔，每只家兔經(jīng)