博卡病毒MVC結(jié)構(gòu)蛋白VP2多克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、目的：犬博卡病毒MVC（Minute Virus of canine）是細(xì)小病毒家族博卡病毒亞家族的成員之一。而VP2作為MVC病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，更是細(xì)小病毒的主要免疫原性抗原，其具有凝血活性的物質(zhì)，是作為決定宿主范圍以及宿主與病毒之間相互作用的關(guān)鍵影響因素。因此，本文通過(guò)構(gòu)建MVC的VP2結(jié)構(gòu)蛋白的原核表達(dá)載體，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化目的蛋白，免疫兔子、制備針對(duì)VP2的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究VP2在MVC病毒

2、致病及感染中的作用，深入揭示MVC病毒致病及感染的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。
　　方法：(1)以本實(shí)驗(yàn)室保存的博卡病毒MVC的感染性克隆載體pIMVC為模板PCR擴(kuò)增VP2基因，并將其產(chǎn)物純化。將純化產(chǎn)物與表達(dá)載體pET32a(+)經(jīng)EcorⅠ、XhoⅠ同時(shí)雙酶切，經(jīng)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到克隆菌株Ecoli.DH5α以及表達(dá)菌株Ecoli.BL21，通過(guò)雙酶切鑒定正確后,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)和鑒定目的蛋白的表達(dá)。

3、目標(biāo)蛋白經(jīng)大量表達(dá)后，回收細(xì)菌超聲裂解并Ni柱純化，以純化產(chǎn)物作為完全抗原免疫新西蘭大白兔。(2)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。(3)以MVC感染W(wǎng)RD（Walter Reed Dog）嗜性細(xì)胞，然后運(yùn)用Western blot和免疫熒光技術(shù)鑒定抗體特異性。
　　結(jié)果：(1)DNA序列測(cè)定及雙酶切鑒定結(jié)果均顯示MVC-VP2基因成功構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET32a(+)上，原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定后證實(shí)成功表達(dá)一相對(duì)分子量（Mr

4、）約為39kd的目的蛋白條帶，VP2目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。
　　(2)以純化得到的MVC-VP2重組蛋白免疫制備得到兔血清，ELISA方法測(cè)得其效價(jià)為1：200000。
　?。?）Western blot、免疫熒光方法證實(shí)VP2多抗血清能夠成功檢測(cè)MVC感染的WRD細(xì)胞，并且具有特性。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了MVC結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2的原核表達(dá)載體pET32a(+)-VP2，并表達(dá)了相應(yīng)的可溶性蛋白。制備了高效