羔羊腦炎腸球菌asa1、ace和esp基因原核表達(dá)及在不同動物腸球菌中的分布研究.pdf

1、腸球菌(Enterococcus)為革蘭氏陽性球菌，是人和動物腸道正常菌群重要成員之一。醫(yī)學(xué)臨床研究已證明了腸球菌的致病性。腸球菌屬共包括16個(gè)種，從臨床標(biāo)本分離的腸球菌以糞腸球菌和屎腸球菌多見。腸球菌之所以能引起感染在于其擁有眾多的毒力因子和獨(dú)特的耐藥機(jī)制。在腸球菌眾多毒力因子中聚集物質(zhì)(asa1)、膠原蛋白黏附素(ace)、腸球菌表面蛋白(esp)都屬于黏附素家族，與腸球菌的黏附和定植有關(guān)，而黏附和定植是細(xì)菌致病的前提。自2002年

2、以來，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)部分規(guī)模化羊場發(fā)生了由腸球菌引起的羔羊腦炎，羔羊的病死率達(dá)20％左右，而對該病的防治缺乏有效手段。本研究以致羔羊腦炎腸球菌為研究對象，對asa1、ace和esp 3種表面蛋白毒力因子基因進(jìn)行克隆及序列分析、構(gòu)建其原核表達(dá)載體，調(diào)查3種毒力因子基因在不同來源腸球菌中的分布，并進(jìn)行序列同源性分析，以期為動物腸球菌感染的免疫預(yù)防、有效診斷以及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.以致羔羊腦炎腸球菌基因組DNA為模板

3、，PCR擴(kuò)增毒力因子asa1、ace和esp基因的部分片段，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體上，通過PCR和雙酶切鑒定后進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果與GenBank上的醫(yī)學(xué)臨床腸球菌的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示：asa1基因同源性在95.5％以上，ace基因同源性在97.8％以上，esp基因同源性在98.9％以上。
　　 2.通過基因重組技術(shù)將致羔羊腦炎腸球菌毒力因子asa1、ace和esp結(jié)構(gòu)基因的部分片段克隆入原核表達(dá)載

4、體pET-28a(+)，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析及Western blot檢測。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出分子量分別為26 kDa、38 kDa和41 kDa的蛋白，Western blot檢測顯示單一條帶。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了致羔羊腦炎腸球菌毒力因子asa1、ace和esp基因的重組表達(dá)載體，表達(dá)出的重組蛋白具有反應(yīng)原性。
　　 3.對來自新疆生產(chǎn)

5、建設(shè)兵團(tuán)128團(tuán)牛場、129團(tuán)牛場、130團(tuán)牛場、克拉瑪依豬場及143團(tuán)雞場健康動物的肛拭和水源進(jìn)行檢測，利用常規(guī)細(xì)菌分離方法和腸球菌高保守的tuf基因設(shè)計(jì)的特異性引物對分離株進(jìn)行PCR檢測。檢測364個(gè)樣本，共分離腸球菌192株。其中，克拉瑪依豬場肛拭分離率41.6％(32/77)，水樣中未分離到；128團(tuán)牛場分離率16％(8/50)，水樣分離到1株；129團(tuán)牛場分離率77.7％(56/72)，水樣分離到2株；130團(tuán)牛場肛拭分離率4

6、6％(25/54)，水樣中分離到1株。143團(tuán)雞場分離率70.5％(67/95)。
　　 4.根據(jù)GenBank公布的腸球菌的毒力因子asa1、ace和esp基因序列設(shè)計(jì)引物，分別檢測來源于牛、羊、豬和雞的腸球菌分離株(共266株)中相應(yīng)的毒力因子基因分布情況，并對不同動物來源腸球菌中3種毒力因子基因克隆測序及序列同源性分析。結(jié)果顯示：腸球菌3種毒力因子基因在來源于牛、羊、豬和雞的266株腸球菌中平均檢出率分別為14.7％(39