感染豬的腸球菌致病機制及溶血素cylA基因的原核表達研究.pdf

1、腸球菌（Enterococcus）是一種在自然界普遍存在的革蘭陽性球菌，也是人和動物腸道的主要菌群。目前，腸球菌屬的細菌種類以達到41種，但糞腸球菌（E．faecelis）和屎腸球菌仍是各種介質(zhì)中主要存在的優(yōu)勢種群。腸球菌在醫(yī)院內(nèi)細菌感染中占有重要的位置，可引起人腹膜炎、心內(nèi)膜炎、尿道炎和腦膜炎等，但近年來，腸球菌對動物感染的報道也越來越多，不但可引起羔羊的腦炎，雞和鴨的敗血癥，還可引起豬的敗血癥、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。 2003～2

2、007年期間，在河南省洛陽、濟源、許昌、南陽、三門峽等地送檢病豬的血液、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、腦組織、關(guān)節(jié)液等分離到42株疑似腸球菌，并通過常規(guī)和分子生物學方法鑒定到種的水平，其中糞腸球菌12株，屎腸球菌30株。為了進一步研究腸球菌對豬感染的致病機理和為以后的免疫和血清學診斷建立基礎(chǔ)，本研究又從鄭州市各集貿(mào)市場市售新鮮豬肉和豬糞便中分別分離了12株和14株腸球菌，對包括感染豬的42株腸球菌在內(nèi)的68株細菌進行了毒力因子的表型和基因型

3、測定、動物實驗，并對腸球菌的主要毒力因子cylA基因進行克隆和原核表達，所有研究內(nèi)容都取得了預期的初步結(jié)果。 細胞溶解素（cyl）和明膠酶是腸球菌的兩種主要致病因子，也是臨床檢查腸球菌致病性兩個主要特征。對68株豬源腸球菌在兔鮮血平板和明膠瓊脂平板溶血和溶解情況進行了測定，發(fā)現(xiàn)感染性菌株具有較高的比率，其中，糞腸球菌β溶血91．7％、明膠溶解100％。 cylA、gelE、efaA、esp、AS和ace被認為是腸球菌的主

4、要致病基因，分別設(shè)計了6對引物利用PCR技術(shù)檢測了68株腸球菌的6種致病基因。根據(jù)檢測結(jié)果：感染豬的腸球菌攜帶有較高比率致病基因，食品和豬糞便腸球菌攜帶的致病基因相對較低，而食品中腸球菌較糞便中腸球菌攜帶的較高：通過比較分離到的兩種腸球菌攜帶的致病基因，發(fā)現(xiàn)不管是感染豬的腸球菌，還是食品或豬糞便中腸球菌，糞腸球菌均攜帶有較高比率的致病基因。在6種致病基因中，感染豬的致病株cylA（100％）、gelE（100％）和efaA （100％）

5、檢出率最高，這說明這三種毒力基因可能發(fā)揮主要致病作用。 動物模型的建立是研究病原菌的致病機理、臨床治療效果、新藥開發(fā)和評價病原菌毒力大小的有效手段。腸球菌為一機會性病原體，而且其致病能力是包括了許多毒力因子在內(nèi)的復雜過程，臨床上主要通過測定其表型來判斷其毒力高低，如檢測其溶血性和明膠溶解試驗，但對于同時存在這兩種表型的菌株的毒力則無從判斷。而且由于腸球菌致病性較弱，直接用腸球菌感染小鼠往往需要較大的細菌數(shù)量，且也不易判斷不同菌株

6、致病性梯度大小關(guān)系，本研究應(yīng)用鼠糞萃取物（SRFE）按20％濃度添加到各糞腸球菌的菌液中，選擇5株攜帶有不同毒力基因糞腸球菌，通過測定各菌株的LD50，成功構(gòu)建了糞腸球菌的腹膜炎致病模型，HE1和HE5攜帶全部6種毒力基因，這兩株糞腸球菌對小鼠的LD50分別為106．01CFU和106．17CFU； HE41僅含有4個毒力基因，缺少esp和AS，HE41的LD50為107．17CFU； HE9和HE10都含有5個毒力基因，HE9缺少ac

7、e，HE10缺少AS，而它們對小鼠的LD50分別為107．01CFU和106．51CFU。 cylA是腸球菌細胞溶解素的激活蛋白基因，根據(jù)豬源腸球菌溶血素基因設(shè)計表達引物，擴增出兩端帶有XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的cylA蛋白基因，亞克隆到原核表達載體pET32a中構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET32a-cylA，在IPTG的誘導下成功表達，獲得了大小約為65．9 KD的融合蛋白cylA-His，與預期結(jié)果相符。為制備單抗、開發(fā)疫苗