腸球菌心內(nèi)膜炎動(dòng)物模型建立及糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原的原核表達(dá)、純化.pdf

1、目的：臨床上腸球菌性心內(nèi)膜炎發(fā)病日益增多，為了更好地研究腸球菌心內(nèi)膜炎，本實(shí)驗(yàn)擬首先建立腸球菌心內(nèi)膜炎兔動(dòng)物模型，然后原核表達(dá)糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原(efaA)蛋白，為臨床腸球菌心內(nèi)膜炎致病機(jī)制、診斷防治及尋求非抗生素療法奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．動(dòng)物模型建立：靜脈導(dǎo)管插入術(shù)建立腸球菌心內(nèi)膜炎動(dòng)物模型。模型建立后解剖取兔肺動(dòng)脈瓣贅生物，通過(guò)稱量贅生物濕重、計(jì)數(shù)贅生物分離培養(yǎng)落數(shù)、菌落PCR檢測(cè)、肺動(dòng)脈瓣病理組織學(xué)HE染色，綜

2、合評(píng)價(jià)模型是否建立成功。 2．efaA蛋白的原核表達(dá)及純化：Genebank中獲得efaA基因全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增efaA基因片段，基因克隆技術(shù)構(gòu)建pET30a-efaA重組載體。采用氯化鈣共沉淀法將重組子轉(zhuǎn)化至E.coli DH5 α和BL21(DE)。PCR、酶切、測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性重組子。IPTG誘導(dǎo)BL21(DE)細(xì)菌重組腸球菌efaA蛋白表達(dá)，SDS-PAGE、 Western Blot方法分析鑒定。His．Bind純化試劑

3、盒，分析重組蛋白的可溶性，親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE分析。 結(jié)果： 1．成功建立腸球菌心內(nèi)膜炎兔模型，兔心內(nèi)膜炎模型心臟可觀察到有贅生物生成。肺動(dòng)脈瓣贅生物重量是148 mg；贅生物勻漿后分離培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)為8.91log<,10>CFU/g；菌落PCR檢測(cè)觀察到與目的條帶大小一致的特異性條帶；肺動(dòng)脈瓣病理組織學(xué)HF染色觀察到有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并見(jiàn)大量由血小板、纖維素、壞死組織、炎癥細(xì)胞、大量細(xì)菌及肉芽組織所