鵝源糞腸球菌毒力因子gelE的克隆、原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的:克隆鵝源糞腸球菌毒力因子gelE基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在BL21中高效表達(dá)，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　方法:
　　1、根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中登錄號為:D85393.1的糞腸球菌明膠酶基因的堿基序列，利用生物信息學(xué)軟件PrimerPremier5.0和Oligo6.0設(shè)計一對特異性引物;提取鵝源糞腸球菌總DNA，做為擴(kuò)增模板;PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物凝膠電泳分離后將目的片段回收;將回收片段與pMD18-T克隆

2、載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中;篩選陽性克隆菌株，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR及單、雙酶切鑒定，鑒定正確后送公司測序。
　　2、將成功克隆的重組質(zhì)粒pMD18-T-gelE進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，與原核表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建pET-28a-gelE重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中;篩選pET-28a-gelE/BL21陽性菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE蛋白電泳鑒定明膠酶蛋白。
　　3、利用生物信息

3、學(xué)軟件對表達(dá)的明膠酶蛋白序列進(jìn)行組分、分子質(zhì)量、滴定曲線與等電點(diǎn)等分析，預(yù)測其一級結(jié)構(gòu)中糖基化位點(diǎn)等;根據(jù)對其可塑性、親水性、抗原性指數(shù)和表面可及性以及β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等的綜合分析，預(yù)測潛在抗原表位。
　　結(jié)果:成功克隆了鵝源糞腸球菌菌株毒力因子gelE基因，其堿基序列為1770bp，編碼590個氨基酸。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pET-28a-gelE/BL21表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后用SDS-PAGE方法鑒定，明膠酶蛋白為7