腸球菌性羔羊腦炎的發(fā)現(xiàn)及其病原特性和診斷方法研究.pdf

1、腸球菌是動物和人類正常菌群的重要組成部分，多作為有益菌進行研究。然而有研究表明，在需氧革蘭陽性球菌中，它是僅次于葡萄球菌的重要院內感染致病菌。美國醫(yī)院感染監(jiān)視系統(tǒng)(NISS)已將其列為引起醫(yī)院感染的第二大病原菌。最近幾年新疆生產建設兵團部分規(guī)?；驁鲞B續(xù)在同一季節(jié)發(fā)生一種以20-40日齡羔羊神經癥狀和敗血癥為主要癥狀和病變特征的傳染性疾病，羔羊的病死率高達20％左右，經病原分離鑒定和回歸試驗確診為腸球菌所致羔羊腦炎，這是羔羊的一種新的疾

2、病，本文圍繞該病的病原特性和診斷方法開展了系列研究，以期為闡明腸球菌對羔羊的致病機理和有效防治該病提供科學數(shù)據，結果如下： 1．腸球菌性羔羊腦炎的發(fā)現(xiàn)及其病原分離鑒定：自2002年新疆生產建設兵團部分規(guī)模化羊場連續(xù)幾年在冬季產羔季節(jié)發(fā)生了一種病程很短，無品種差異，主要感染羔羊、可引起死亡的、以敗血癥和神經癥狀為主要特征的傳染病。先后從不同羊場發(fā)生腦炎癥狀的羔羊體內分離到11株細菌，經形態(tài)學、培養(yǎng)特性、生化反應、血清學以及動物試驗

3、確定是由腸球菌屬的某些種引起。 2．檢測羔羊腸球菌性腦炎間接ELISA方法建立和初步應用：利用超聲波裂解制備致羔羊腦炎糞腸球菌裂解物作為抗原包被酶標板，應用棋盤滴定法，通過條件篩選成功建立了致羔羊腸球菌抗體測定的間接ELISA方法。應用該方法檢測羔羊腸球菌陽性血清，其靈敏度是微量凝集反應的25-100倍。利用建立的方法檢測來自未免疫羊場的50份成年羊血清和30份羔羊血清，結果顯示有2份成年羊血清呈陽性。 3．檢測羔羊腸球

4、菌性腦炎PCR方法建立和初步應用：以致羔羊腦炎糞腸球菌基因組為模板，以相對保守的腸球菌的tuf基因為基礎設計一對引物，通過條件篩選成功的建立了用于致羔羊腦炎腸球菌快速診斷的PCR方法，其靈敏度在10fg。應用該方法檢測自然感染羔羊和人工感染發(fā)病死亡羔羊以及人工感染發(fā)病死亡小鼠主要器官組織，即在心、肝、脾、腎、腦、腦脊液等組織中均檢測到了腸球菌DNA，其中2只人工感染死亡羔羊還在肺門淋巴結和腸系膜淋巴結中檢測到腸球菌DNA。 4.

5、免疫組化檢測羔羊糞腸球菌性腦炎及其抗原定位的研究：以導致羔羊腦炎的糞腸球菌為研究對象，人工感染小鼠，通過條件優(yōu)化，建AT腸球菌性羔羊腦炎檢測的間接免疫組化方法。用該方法定期檢測糞腸球菌在試驗小鼠體內的分布，結果顯示：4h時可在小鼠的肝臟中檢測到糞腸球菌的陽性顆粒；14h時在腎臟和心臟中檢測到陽性顆粒；18h可在食道中檢測到糞腸球菌陽性顆粒；20h在腦中檢測到陽性顆粒；22h在肺臟和氣管中檢測到糞腸球菌陽性顆粒；24h可在除脾臟外所有受檢

6、組織即腦、肝、心臟、腎、氣管、肺、食道及小腸中觀察到糞腸球菌的陽性顆粒。 5.致羔羊腦炎腸球菌毒力因子的分子流行病學調查：對11株致羔羊腦炎腸球菌ace、efa、cylA、gelE、asal和asa373、esp、EF0591和EF3314等9種毒力因子基因的PCR檢測結果表明，5/11株腸球菌檢測到esp、cylA、asal、ace、efa、EF0591和EF3314等7種毒力因子基因。1/11株檢測到esp、gelE、asa

7、l、ace、efa和EF3314等6種毒力因子基因，1/11株檢測到cylA、asal、ace、efa、EF0591和EF3314等6種毒力因子基因，1/11株檢測到esp、cylA、asal、ace、EF0591和EF3314。1/11株菌僅攜帶esp基因。2/11株菌未檢測上述9種毒力因子基因任何一種。與人類醫(yī)學其它來源腸球菌毒力因子攜帶情況不同。 6.致羔羊腦炎糞腸球菌8種毒力因子基因片段克隆和序列特征研究：將致羔羊腦炎糞

8、腸球菌檢測到的的8個毒力因子ace、efa、cylA、gelE、asal、esp、EF3314和EF0591基因部分片段克隆到pMD19-T載體上，應用PCR及酶切方法檢測出陽性克隆并進行序列測定。通過BLAST軟件對致羔羊腦炎糞腸球菌各毒力基因擴增片段的測定序列與GeneBank公布的醫(yī)學臨床分離株相應序列進行同源性分析比較，結果顯示兩種來源8種毒力因子基因目的片段序列的同源性分別為99.3％、99.56％、99.3％、97.85％、

9、96.64％、99.9％、99.29％和98.11％。 7.致羔羊腦炎腸球菌與臨床健康羔羊分離的腸球菌生物學特性的比較研究：通過研究發(fā)現(xiàn)羔羊兩種來源腸球菌的培養(yǎng)特性和生化特性基本一致；對某些抗生素有不同程度的耐藥性；致病株有更多的毒力因子組合；對兩者共有的毒力因子基N JCN進行克隆與序列分析，并同時與GeneBank來自醫(yī)學臨床分離株相應毒力因子基因片段比對分析，其同源性很高，均在95％以上。正常菌群株不能引起小鼠的死亡，而致

10、病株可導致小鼠的死亡。 8.致羔羊腦炎糞腸球菌在人工感染小鼠疾病模型體內分布規(guī)律及病理學研究：經不同途徑用致羔羊腦炎糞腸球菌分離株感染小鼠，最佳途徑是腹腔注射，皮下注射次之，鼻腔吸入不引起感染。對小鼠的LD<,50>為9.3×10<'10>CFU。定期剖殺腹腔接種致羔羊腦炎糞腸球菌的小白鼠，用2種不同的方法檢測在細菌主要臟器中的分布。結果發(fā)現(xiàn)感染2h后用PCR方法即可從腦、肝和心血檢測到糞腸球菌DNA。6h后不僅能檢測到腸球菌：