日本腦炎病原檢測(cè)與免疫防治方法的研究.pdf

1、日本腦炎（Japanese encephal itis，JE）是由日本腦炎病毒（JapaneseEncephal itis Virus，JEV）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病。本病在世界許多國(guó)家廣泛存在，不但對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅著人類的健康。JE的診斷可以通過(guò)臨床檢測(cè)結(jié)合流行病學(xué)進(jìn)行，確診需要實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)。目前，乙腦的治療沒(méi)有有效的方法，只有進(jìn)行疫苗接種結(jié)合滅蚊工作進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn)從乙腦的檢測(cè)和防治方面

2、做了以下研究。
　　 一、日本腦炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　 本實(shí)驗(yàn)分別以JEV保守的prM，NS1及E基因片段為模板設(shè)計(jì)三對(duì)引物，篩選基于SYBR GreenⅠ模式的實(shí)時(shí)熒光PCR的最佳引物，以建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)日本腦炎病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。以測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并方法的敏感性、特異性、可重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，以E蛋白核苷酸序列957-1431b

3、p區(qū)域作為模板設(shè)計(jì)的引物，靈敏度較其他兩個(gè)高，該方法只從JEV陽(yáng)性樣本檢出擴(kuò)增信號(hào)，不與其它病原出現(xiàn)交叉反應(yīng)；熔解溫度為86.2±0.5℃，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析只出現(xiàn)1個(gè)單特異峰，無(wú)引物二聚體；在1×103～1×109拷貝之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，擴(kuò)增效率94.2％，最低可檢測(cè)1000拷貝以下反應(yīng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，比常規(guī)PCR敏感至少103倍；組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)分別為0.53％-1.42％、1.16％。對(duì)16例豬

4、乙腦臨床疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為81.25％（13/16），陽(yáng)性樣品擴(kuò)增片段大小為475bp，與預(yù)期大小相當(dāng)。本研究建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)迅速，為JEV的快速檢測(cè)、分子流行病學(xué)調(diào)查提供新方法。
　　 二、一株豬源日本腦炎滅活疫苗配伍不同的佐劑在小鼠體內(nèi)的免疫特性研究
　　 為了評(píng)價(jià)發(fā)展一種有效的由Vero細(xì)胞增殖的豬源日本腦炎疫苗，本研究以一株從蚊體中分離得到的豬源日本腦炎病

5、毒NJ2008株作為滅活疫苗研究用種毒，經(jīng)BHK細(xì)胞增殖后病毒效價(jià)可達(dá)108.67TCID50/mL。將病毒接種于長(zhǎng)滿Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶上培養(yǎng)，收集病毒液，經(jīng)純化、濃縮后以0.2％的福爾馬林滅活，病毒經(jīng)福爾馬林滅活后分別與Montanide ISA15AVG白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏不完全佐劑（FIA）和蜂膠佐劑配伍制成滅活疫苗。4～6周齡的BALB/c小鼠（均為雌性），隨機(jī)分為6組，每組12只，前四組進(jìn)行不同佐劑的滅活疫苗的免疫，第五、