利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆梅山豬.pdf

1、由于在解剖、生理、遺傳等方面比小鼠更加接近于人類，作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的豬被認(rèn)為是人異種器官移植理想的器官提供者及開(kāi)展人類疾病研究的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀?br>　　 豬器官的獲得及模型的制備需要借助胚胎工程提供豐富的素材。當(dāng)前，以體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因、多能干細(xì)胞等技術(shù)為代表的豬的胚胎工程尚不完善，尤其是起始材料——體外培養(yǎng)得到的豬卵母細(xì)胞、胚胎質(zhì)量不高，反映出豬卵母細(xì)胞、胚胎體外培養(yǎng)體系不理想。因此，需進(jìn)一步優(yōu)化豬卵母細(xì)胞體外成熟、胚胎培養(yǎng)體系

2、。本研究首先嘗試添加重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（hGMCSF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），以期獲得高效、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的豬卵/胚胎體外培養(yǎng)配方；還針對(duì)胚胎遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)默F(xiàn)實(shí)需要，研制了高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的胚胎運(yùn)輸裝備，為胚胎生產(chǎn)/利用效率提高、轉(zhuǎn)基因克隆豬生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)一旨在借助性染色體特異片段設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)雙基因PCR法快速鑒定豬胎兒成纖維細(xì)胞。對(duì)實(shí)驗(yàn)室的七株梅山豬成纖維細(xì)胞系提取細(xì)胞基因組DNA，根據(jù)X

3、,Y染色體上的特異性片段Sry、ZFx/y設(shè)計(jì)兩條特異性引物，PCR法快速成纖維細(xì)胞系進(jìn)行性別鑒定。成功鑒定出msz4、msz5、msz11、msz15四個(gè)雄性細(xì)胞系，msz6、msz9、msz14三個(gè)雌性細(xì)胞系。
　　 實(shí)驗(yàn)二首先研究hGMCSF添加至非限定性成熟培養(yǎng)基(PIVM)中對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響。實(shí)驗(yàn)組分別添加2 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml和 100 ng/ml的hGMCSF，對(duì)照組不添加hGMC

4、SF（即0 ng/ml）。我們發(fā)現(xiàn)PIVM添加2ng/ml、10ng/ml或50ng/ml的hGMCSF對(duì)卵母細(xì)胞成熟率無(wú)顯著影響。而100ng/ml組所獲成熟卵孤雌后囊胚率與對(duì)照組相比明顯下降（34.83±5.50％ vs．58.83±4.55％，P<0.05），雖然卵母細(xì)胞的成熟率無(wú)明顯改變。隨后，我們又在化學(xué)限定性培養(yǎng)基（不含任何蛋白成分的PIVM）里添加2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的hGMCSF（0ng/ml為對(duì)

5、照組），以探明hGMCSF對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的真實(shí)影響，成熟率亦沒(méi)有顯著變化（53.63±4.68％、45.38±3.03％、49.63±1.35％、52.13±2.72％，P>0.05），且成熟卵孤雌后胚胎后期的發(fā)育率也沒(méi)有顯著差異(25.88±3.69％、29.87±4.10％、24.63±5.27％、23.75±3.63％，P>0.05)。我們還研究了 hGMCSF（胚胎培養(yǎng)期間，在PZM3中分別添加2ng/ml、10ng/ml、5

6、0ng/ml的hGMCSF，以不添加組為對(duì)照）對(duì)豬孤雌胚體外發(fā)育的影響。
　　 結(jié)果表明，胚胎培養(yǎng)期間，在非限定胚胎培養(yǎng)基PZM3中添加hGMCSF對(duì)卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率均無(wú)促進(jìn)作用（P>0.05），但是添加10ng/ml、50ng/ml的hGMCSF組，可以提高囊胚總細(xì)胞數(shù)（79±7、79±8、48±5，P＜0.05）。在化學(xué)限定胚胎培養(yǎng)基PZM4中添加上述濃度的hGMCSF，胚胎卵裂率（90.43±2.41％、90.4

7、3±2.41％、90.57±2.82％、90.57±1.90％，P>0.05），囊胚率（18.57±5.48％、16.14±4.70％、18.57±4.47％、17.86±5.61％，P>0.05）無(wú)明顯改善。
　　 實(shí)驗(yàn)三：旨在研究bFGF對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響，以篩選出有益于提高豬卵成熟質(zhì)量的bFGF添加濃度及時(shí)間。處理組添加2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的bFGF（不含bFGF的培養(yǎng)基作為對(duì)照組）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

8、，10ng/ml的bFGF可顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率（84.17±3.51％vs68.83±3.72％，P<0.05）及孤雌后的囊胚率（56.67±3.96％vs34.33±4.57％，P<0.05）、囊胚孵化率（10.50±4.99％vs0.00±0.00％，P<0.05）和囊胚總細(xì)胞數(shù)（65±4vs34±4，P<0.05）。為探明bFGF對(duì)豬孤雌胚胎體外發(fā)育的影響，我們分別將2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的bFGF（對(duì)

9、照組為不含bFGF的胚胎培養(yǎng)基）加入胚胎培養(yǎng)基中，對(duì)常規(guī)體外成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活、培養(yǎng)，通過(guò)胚胎卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率以及總細(xì)胞數(shù)綜合判定bFGF的作用。結(jié)果表明，當(dāng)使用非化學(xué)限定培養(yǎng)基PZM3時(shí)，添加bFGF對(duì)孤雌胚體外發(fā)育影響不明顯；而在化學(xué)限定性胚胎培養(yǎng)基PZM4中添加不同濃度bFGF(0ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml）的孤雌胚的囊胚發(fā)育率（25.40±7.90％、3 7.60±6.52％、3

10、6.40±3.52％、2 9.40±3.43％，P>0.05）和囊胚孵化率（0.00±0.00％、0.00±0.00％、1.60±1.60％、0.00±0.00％，P>0.05）有提高的趨勢(shì)，盡管無(wú)顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)四：嘗試用研制簡(jiǎn)易運(yùn)輸裝置以替代昂貴的商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)輸送器運(yùn)輸胚胎。以實(shí)驗(yàn)室CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)作為對(duì)照組，揭示自制胚胎運(yùn)輸器運(yùn)輸、運(yùn)輸時(shí)間對(duì)胚胎體外發(fā)育的影響。結(jié)果表明，除自制裝置運(yùn)輸2h組之外，囊胚率方面其

11、他組都較對(duì)照組略有下降（P>0.05）。自制裝置不同運(yùn)輸時(shí)間均獲得孵化囊胚，尤其是2h組明顯優(yōu)于其他各組（P＜0.05）。自制裝置運(yùn)輸2h組、3h組、細(xì)胞輸送器4h運(yùn)輸組的ICM數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比值顯著高于其他組（P＜0.05）。
　　 實(shí)驗(yàn)五：我們從201010月起，以梅山豬轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(msz6轉(zhuǎn) pEGFPN1)為供體共構(gòu)建1080枚胚胎，移植給9頭代孕母豬輸卵管內(nèi)，其中1頭代孕母豬產(chǎn)下四頭健康仔豬。經(jīng)PCR檢測(cè)，均為轉(zhuǎn)基因克

12、隆豬。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首先利用SRYPCR法快速準(zhǔn)確的鑒定出七株梅山豬成纖維細(xì)胞系的性別，并發(fā)現(xiàn)：在豬的卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎的體外培養(yǎng)中，添加hGMCSF不能顯著的促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和胚胎的發(fā)育，10ng/ml的bFGF顯著提高卵母細(xì)胞的核成熟和胞質(zhì)成熟，而將bFGF僅添加于胚胎培養(yǎng)基中，對(duì)胚胎的發(fā)育和質(zhì)量卻無(wú)顯著影響。我們自制的細(xì)胞簡(jiǎn)易運(yùn)輸裝置、經(jīng)濟(jì)、易操作，使用該裝置在3h時(shí)間內(nèi)運(yùn)輸胚胎效果最佳。利用所建立的體細(xì)胞克