利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊的研究.pdf

1、動物轉(zhuǎn)基因是目前生物領(lǐng)域的研究熱點之一,其基本特征是改變了動物的遺傳組成,使動物按照人們的意愿進行改造.以傳統(tǒng)的原核顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率非常低下(成功率僅為3~5﹪),嚴重地制約了轉(zhuǎn)基因動物研究進展.與之相比,體細胞克隆技術(shù)在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物方面有著不可比擬的優(yōu)越性.利用體細胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)點是:轉(zhuǎn)基因操作主要是集中在細胞水平上完成,從而極大地提高了生產(chǎn)效率、降低了生產(chǎn)成本和減少了工作強度;在體外可以監(jiān)控轉(zhuǎn)基因的表達

2、水平,以便獲得高效表達轉(zhuǎn)基因動物;對基因進行定點修飾,促進生物醫(yī)藥、功能基因組等方面的研究.該實驗以Myostatin基因為靶基因、含有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、胸苷激酶、LoxP位點的雙標記選擇載體作為框架結(jié)構(gòu)、羊胎兒成纖維細胞和成年耳部成纖維細胞系為轉(zhuǎn)染細胞,測定了不同轉(zhuǎn)染方法(磷酸鈣法,脂質(zhì)體法及電擊法)的轉(zhuǎn)染效果,篩選陽性細胞克隆,借助體細胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎.建立了一套完整的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)制備、體細胞的傳代培養(yǎng)、體

3、細胞性別鑒定、轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因細胞系建立、轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的生產(chǎn)等操作程序,為羊轉(zhuǎn)基因體細胞克隆提供了行之有效的實驗方法.通過實驗證明,構(gòu)建的ploxP-M雙標記同源重組轉(zhuǎn)基因載體可以很好地實現(xiàn)基因敲除目的.磷酸鈣法、:脂質(zhì)體法及電擊法可有效地轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞,但以電擊法效果為最佳,該轉(zhuǎn)染方法還具有適合于不同片段大小、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點.在隨機整合細胞系中由于插入位點和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的不同造成了熒光蛋白表達水平的差異,但更重要的是