利用體細(xì)胞核移植及嵌合體技術(shù)制備熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬的研究.pdf

1、豬在體型大小、消化代謝和基因組等方面都與人的極為相似，是人類(lèi)疾病模型和異種器官移植研究的理想動(dòng)物，轉(zhuǎn)熒光蛋白報(bào)告基因的工具豬在異種移植、嵌合體和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)和嵌合體技術(shù)，進(jìn)行構(gòu)建綠色熒光蛋白示蹤的工具豬及嵌合體豬的研究。
　　1、構(gòu)建α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除(GTKO)小型豬（巴馬、五指山）原代耳成纖維細(xì)胞系，利用脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，G418篩選獲得了可用于后續(xù)試

2、驗(yàn)的綠色熒光蛋白(EGFP)和橘紅色熒光蛋白(huKO)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　2、EGFP陽(yáng)性克隆點(diǎn)細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植和胚胎移植，移植559枚胚胎到3頭受體母豬，1頭母豬分娩產(chǎn)出2個(gè)EGFP陽(yáng)性克隆豬。采樣心、肝、脾、肺、腎、胰腺、腸、胃、舌、大腦、小腦、脊髓和骨骼肌肉等13種組織進(jìn)行石蠟切片觀察、Western和實(shí)時(shí)定量PCR分析，結(jié)果顯示EGFP為全身性表達(dá)，但是在肝臟、大腦、小腦和脊髓中的表達(dá)較弱。
　　3、顯微注

3、射iPS細(xì)胞構(gòu)建嵌合體胚胎，胚胎移植進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證iPS細(xì)胞的全能性。共計(jì)移植602枚嵌合胚，獲得9個(gè)胎兒（其中1-5#進(jìn)行PCR檢測(cè)）。通過(guò)小動(dòng)物活體和體式熒光觀測(cè)未發(fā)現(xiàn)有EGFP表達(dá);PCR檢測(cè)顯示1#胎兒頭部和2#胎兒胎盤(pán)檢測(cè)到EGFP基因。
　　4、通過(guò)注射和聚合法進(jìn)行嵌合體豬的研究，共移植了436枚胚胎;但是未獲得嵌合體胎兒。
　　總之，本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)成功獲得了GFP廣泛表達(dá)的GTKO豬，建立了制備嵌合體