小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉(zhuǎn)錄組及肌球蛋白輕鏈基因家族結(jié)構(gòu)特征分析.pdf

1、綿羊是羊肉的重要來源，隨著羊肉價(jià)格的逐漸盤升，如何提高羊只的產(chǎn)肉量、改善羊肉品質(zhì)成為亟待解決的問題。研究不同生長性能綿羊骨骼肌間的全轉(zhuǎn)錄組和差異表達(dá)將有助于揭示肌肉生長和發(fā)育的分子機(jī)制。
　　近年來，基于第二代高通量測序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)可以實(shí)現(xiàn)快速、全面地獲得特定組織于某個(gè)狀態(tài)下幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本。本試驗(yàn)以生長性能顯著不同的兩只小尾寒羊和杜泊羊的臂二頭肌為試驗(yàn)材料，分別構(gòu)建了它們的轉(zhuǎn)錄組文庫，并采用Illumina

2、 HiSeq2000高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序;獲得的測序序列與綿羊參考基因組和參考基因比對后全面揭示兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫的特征，包括基因表達(dá)、基因注釋、差異基因、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本、cSNP和SSR等;以qRT-PCR法對從中隨機(jī)選取的12基因進(jìn)行了相對定量分析對高通量測序數(shù)據(jù)的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證;采用RACE等方法克隆了小尾寒羊和杜泊羊MYL1、MYL2、MYL3和MYL4基因的全長cDNA序列，利用GENSCAN等生物軟件對cDNA序列以及編碼

3、蛋白的結(jié)構(gòu)特征等方面加以分析，并對這幾個(gè)基因在綿羊的不同組織間mRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)經(jīng)RNA-Seq分析，分別在小尾寒羊和杜泊羊的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫中得到50264608和52794216條長為90 bp高質(zhì)量的測序序列。這些序列中各有約三分之二以上的序列可以比對到綿羊的參考基因組中，而有42.77％和33.10％的序列被可被比對到綿羊的20236個(gè)參考基因上。在綿羊臂二頭肌中，只有約1％的參考基因?qū)儆?/p>

4、高表達(dá)基因(RPKM≥1000)，而93％以上的基因?yàn)榈捅磉_(dá)基因(RPKM≤1000)。
　　(2)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫間發(fā)現(xiàn)有1300個(gè)差異表達(dá)基因(FDR≤0.001且| log2Ratio|≥1)，其中有554個(gè)基因在小尾寒羊中表達(dá)上調(diào)而746個(gè)表達(dá)下調(diào)。對它們進(jìn)行GO功能注釋時(shí)發(fā)現(xiàn)分別有1066、1137和1067個(gè)基因可被注釋到GO的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能條目中。而1152個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫的240

5、條通路中，其中以新陳代謝通路（含有114個(gè)基因）和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通路（21個(gè)基因）包含基因最多。綜合兩方面的注釋結(jié)果共發(fā)現(xiàn)有31個(gè)差異表達(dá)基因與肌細(xì)胞發(fā)育、分化和骨骼肌的生長相關(guān)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因中的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分——整合蛋白ITGA8和膠原蛋白COL4A1與其他蛋白間互作最多，而肌球蛋白(myosin)、肌鈣蛋白(troponin)以及一些與生長和發(fā)育密切相關(guān)的調(diào)節(jié)因子（IGFBP5、TGFBR3和VEGF）與其

6、他基因的互作較少。
　　(3)在小尾寒羊和杜泊羊文庫中分別存在著40481和38851個(gè)潛在的cSNPs以及4721個(gè)SSRs，并分別以A→G和(AC)n為主要的分子標(biāo)記。其中cSNPs主要分布于綿羊的1、2和3號染色體上。
　　(4)小尾寒羊和杜泊羊文庫中分別有37.72％和39.03％表達(dá)的基因發(fā)生了可變剪接，并以A3SS為主要的剪接方式。依照測序序列對6989個(gè)參考基因的兩端或一端進(jìn)行了延伸和優(yōu)化。共發(fā)現(xiàn)了123678

7、個(gè)平均長為343 bp的新轉(zhuǎn)錄本單元。
　　(5)克隆得到了綿羊MYL1、MYL2、MYL3和MYL4基因的全長cDNA序列。其中MYL1基因包括長度不同的兩條cDNA序列，二者在5'端有所不同而3'端的序列相同。將這些序列提交至GenBank，登錄號分別為KJ700419、KJ710701、KJ710702、KJ710703、KJ710704、KJ710705、KJ710706、KJ710707和KJ768855。同一個(gè)基因的c

8、DNA序列在兩個(gè)品種間的同源性均高于與NCBI中預(yù)測序列的同源性，主要表現(xiàn)為5'端和3'端長度和序列的不同。
　　(6)綿羊MYL1、MYL2、MYL3和MYL4基因均包括5個(gè)外顯子，它們的起始密碼子上游5'側(cè)翼序列中含有大量肌細(xì)胞增加因子MEF2以及生肌調(diào)節(jié)因子MyoD和MyoG的結(jié)合位點(diǎn)。
　　(7)綿羊MYL1a、MYL1b、MYL2、MYL3和MYL4蛋白中只有1～2個(gè)氨基酸與NCBI中的預(yù)測序列不同。序列分析結(jié)果表

9、明它們均為偏酸性蛋白、親水性較好、無信號肽、有多個(gè)糖基化和磷酸化位點(diǎn);二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主;三級結(jié)構(gòu)以人肌球蛋白輕鏈Ⅱ?yàn)樽罴涯０?，兩端呈對稱性桶狀;聚類結(jié)果顯示脊椎動(dòng)物中綿羊與山羊、人與大熊貓、灰鼠猴子與獼猴、小鼠與褐家鼠、牛和牦牛、貓與狗相近，而斑馬魚和爪蟾與以上脊椎動(dòng)物相距最遠(yuǎn)。
　　(8)綿羊MYL1基因主要在背最長肌中表達(dá)，兩種可變剪接體MYL1a在杜泊羊中表達(dá)量高于小尾寒羊，而MYL1b在小尾寒羊中表達(dá)量高于