非肌肉型肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈在大鼠腦缺血-再灌注損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、1、背景和目的:腦在缺血一定時(shí)間并恢復(fù)血液灌流后，損傷出現(xiàn)加重的矛盾現(xiàn)象，稱為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemiareperfusion injury, CI/R)。腦缺血/再灌注損傷涉及多種機(jī)制，氧化應(yīng)激是其中重要機(jī)制之一。
　　氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧(ROS)產(chǎn)生過(guò)多和/或抗氧化能力降低，使得ROS在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積而引起的組織細(xì)胞氧化損傷過(guò)程。機(jī)體內(nèi)生成ROS的酶系很多，而NADPH氧化酶(NOX)來(lái)源的RO

2、S在心血管系統(tǒng)疾病中的作用最受關(guān)注。
　　腦缺血/再灌注損傷時(shí)，NOX的活性和表達(dá)會(huì)有顯著升高，伴隨ROS水平上升和腦組織損傷。目前雖然有文獻(xiàn)報(bào)道NOX來(lái)源的ROS在腦缺血/再灌注氧化損傷中發(fā)揮重要作用，但對(duì)NOX各亞型表達(dá)情況尚缺乏系統(tǒng)全面的研究，對(duì)腦缺血/再灌注時(shí)NOX表達(dá)變化機(jī)制則知之甚少。
　　非肌肉型肌球蛋白輕鏈(non-muscle myosin light chain，MLC20)是非肌肉型肌球蛋白Ⅱ的組成部分

3、，MLC20的磷酸化水平受肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)調(diào)節(jié)。MLC20磷酸化水平的改變涉及到多種疾?。òX卒中）的發(fā)生發(fā)展。有研究表明MLC20磷酸化水平升高可能與腦缺血損傷密切相關(guān)，但機(jī)制不詳。
　　已有文獻(xiàn)報(bào)道，人肺內(nèi)皮細(xì)胞的MLCK通過(guò)磷酸化MLC20調(diào)節(jié)NOX的激活和ROS的產(chǎn)生，如前所述，NOX在介導(dǎo)腦缺血/再灌注氧化損傷中發(fā)揮重要作用，我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，這一現(xiàn)象是否與MLC20磷酸化水平變化有關(guān)？
　

4、　基于文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)腦缺血/再灌注時(shí)MLC20可能通過(guò)其蛋白磷酸化水平變化參與了NOX活性和/或表達(dá)調(diào)節(jié)。
　　2、方法:采用腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，雄性SD大鼠(250～300g)70只，隨機(jī)分為7組，每組10只:①正常對(duì)照組（Control組）;②假手術(shù)組（Sham組）;③腦缺血再灌注組（CI/R組）;④MLCK特異性抑制劑ML-7+腦缺血再灌注組（CI/R+ML-7組）;⑤N

5、OX抑制劑DPI+腦缺血再灌注組（DPI+CI/R組）;⑥NOX抑制劑apocynin+腦缺血再灌注組（apocynin+CI/R組）;⑦溶媒+腦缺血再灌注組（CI/R+溶媒組）。采用Bederson評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)學(xué)功能進(jìn)行評(píng)分，HE染色觀察病理組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，TTC染色觀察并計(jì)算梗死灶體積，DNA缺口末端原位標(biāo)記（TUNEL）染色觀察細(xì)胞凋亡。收集各組動(dòng)物腦組織，比色法測(cè)定腦中H2O2的含量、NOX、caspase-3活性，ELIS

6、A法測(cè)腦組織中MLCK的活性。收集腦組織并提取RNA和蛋白，測(cè)定NOX1-4的mRNA表達(dá)，NOX1、2、4及p-MLC20的蛋白表達(dá)。
　　3、結(jié)果:(1)與對(duì)照組相比，腦缺血/再灌注組大鼠死亡率顯著升高，并伴隨明顯的神經(jīng)學(xué)功能缺陷和腦梗死灶，這些現(xiàn)象均可被ML-7、DPI或apocynin顯著減輕;
　　(2)與對(duì)照組相比，腦缺血/再灌注組大鼠腦組織水腫，有空泡形成，核固縮溶解，核仁消失，神經(jīng)元間隙擴(kuò)大，排列失去正常規(guī)則

7、。給予ML-7、DPI或apocynin處理后，神經(jīng)元損傷明顯減輕，損傷神經(jīng)元數(shù)量減少，缺血區(qū)域存活神經(jīng)元增多，邊界及核仁清楚，只有部分細(xì)胞出現(xiàn)胞核萎縮，胞漿消失。
　　(3)對(duì)比正常對(duì)照組，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和caspase-3活性在缺血/再灌注組大鼠腦組織中顯著增加，ML-7、DPI或apocynin干預(yù)組，凋亡細(xì)胞數(shù)和caspase-3活性顯著下降。
　　(4)與正常組相比，腦缺血/再灌注組大鼠腦組織中NOX2，NO

8、X4的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，H2O2含量和NOX活性顯著增加，這些變化均可被ML-7、DPI或apocynin減弱;
　　(5)與正常組相比，缺血/再灌注組大鼠腦組織MLCK活性顯著升高，伴隨總蛋白和核蛋白中MLC20蛋白磷酸化水平顯著上調(diào)，這些現(xiàn)象可被MLCK抑制劑ML-7減弱，但不受NOX抑制劑的影響。
　　4、結(jié)論:腦缺血/再灌注時(shí)，NOX2和NOX4基因表達(dá)上調(diào)和NADPH氧化酶活性升高是導(dǎo)致缺血/再灌注氧