Homer1a在小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制研究.pdf

1、缺血性腦損傷是臨床上常見疾病，在世界人口死亡疾病譜中排名第二，嚴(yán)重威脅著人類健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，每年約有570萬人因該疾病致殘、致死，給社會和家庭造成沉重經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。該疾病的發(fā)病原因主要是腦組織供血中斷，短時間內(nèi)不能恢復(fù)血供引起。在臨床上，早期溶栓恢復(fù)血供是其基本治療策略。然而，研究認(rèn)為，人腦在缺血超過4.5h后，雖然恢復(fù)血供，但可激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)引起缺血后的再灌注損傷。遺憾的是臨床上患者的治療絕大多數(shù)已經(jīng)錯過這一時間窗，因此

2、常見的缺血性腦損傷多數(shù)為再灌注損傷。目前有關(guān)腦缺血再灌注損傷的致病機制主要有氨基酸興奮性毒性、自由基損傷、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等各種病理機制學(xué)說。深入研究這些發(fā)病機制及干預(yù)策略成為治療腦缺血再灌注損傷急需解決的問題。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜骨架蛋白—Homer蛋白在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。作為突觸后膜骨架蛋白，Homer蛋白是參與突觸構(gòu)成及介導(dǎo)神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的一類關(guān)鍵蛋白分子。其中，研究

3、最為廣泛的是Homer1蛋白。通過即早型基因和構(gòu)成型基因的不同編碼表達(dá)，Homer1主要分為 Homer1a和Homer1b/c兩種蛋白。Homer1a蛋白屬于即早基因表達(dá)，生理條件下幾乎不表達(dá)，神經(jīng)元細(xì)胞損傷或者被刺激后啟動快速表達(dá)，而Homer1b/c蛋白則屬于構(gòu)成型蛋白，在體內(nèi)常規(guī)表達(dá)。兩種蛋白在功能上相互具有拮抗性調(diào)節(jié)作用。因Homer1蛋白可以調(diào)節(jié)突觸后膜受體叢集、細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，形成連接復(fù)合體等作用，臨床前實驗研究已經(jīng)暗示

4、Homer1蛋白與許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。在前人實驗研究中發(fā)現(xiàn)，顱腦創(chuàng)傷性損傷、細(xì)胞氧糖剝奪模型損傷中均可發(fā)現(xiàn)Homer1a蛋白早期快速高表達(dá)，而Homer1b/c蛋白恒定表達(dá)。并且深入研究發(fā)現(xiàn)，這種高表達(dá)的Homer1a蛋白可以通過負(fù)性調(diào)節(jié)并拆解 Homer1b/c蛋白參與形成的各種蛋白復(fù)合體，從而抑制諸如興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載等損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此我們猜測，在腦缺血再灌注損傷中，可能同樣存在該種作用機制，而這種

5、研究在動物實驗中卻未見報道。本實驗的目的是期望應(yīng)用Homer1a基因敲除小鼠，敲除Homer1a蛋白表達(dá)，從而在動物實驗中明確Homer1a在腦缺血再灌注損傷中的作用，以及初步探索該作用的機制。
　　實驗一、Homer1a基因敲除小鼠的繁殖培育與基因鑒定
　　目的：繁殖培育及鑒定Homer1a基因敲除小鼠。
　　方法：通過應(yīng)用由美國約翰霍普金斯大學(xué)Paul F.Worley教授贈送的Homer1a基因敲除種鼠進行配對繁

6、殖，并通過鼠尾提取基因組進行PCR及凝膠電泳鑒定子鼠基因型。
　　結(jié)果：共繁殖培育子鼠142只，其中野生型小鼠42只，雜合子型小鼠79只，Homer1a基因敲除純合子小鼠21只。
　　結(jié)論：本實驗結(jié)果表明，成功繁殖并鑒定出野生型及基因敲除型小鼠，為后續(xù)試驗提供了可靠的實驗動物來源。
　　實驗二、Homer1a在小鼠局灶性缺血再灌注腦損傷中的保護作用及對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化影響
　　目的：通過比較Homer1a基因敲除

7、小鼠與野生型小鼠，明確Homer1a蛋白在小鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用，及對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。
　　方法：取雄性Homer1a基因敲除（Knock Out，KO）小鼠及同窩野生型（Wild Type，WT）小鼠，分為基因敲除假手術(shù)組（Sham Knock Out，SKO）、野生型假手術(shù)組（Sham Wild Type，SWT）、基因敲除缺血再灌注損傷模型組（Model Knock Out，MKO），野生型缺血再灌注損傷模

8、型組（Model Wild Type，MWT）四組，進行mNSS行為學(xué)檢測、HE染色觀察腦組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)、TTC腦梗死體積百分比計算、TUNE凋亡檢測及 GFAP熒光染色。
　　結(jié)果：可以通過HE染色觀察到梗死區(qū)細(xì)胞水腫、崩解、細(xì)胞稀疏，核固縮等。小鼠腦缺血再灌注損傷后，比較Homer1a基因敲除小鼠與野生型小鼠發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠行為學(xué)損傷加重、腦梗死體積百分比升高、細(xì)胞凋亡率增高。腦缺血再灌注損傷后，小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP免疫