五個(gè)新的鴨β-防御素的分離、鑒定及其抗病毒機(jī)制的初探.pdf

1、防御素是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，具有抑制細(xì)菌、真菌和囊膜病毒的作用，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制避免了傳統(tǒng)抗生素易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，有望代替抗生素成為新型的飼料添加劑。禽抗菌肽屬于β-防御素類，具有高效、廣譜的抗菌活性，在禽類先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。
　　 本研究采用RT-PCR方法，分別從鴨肺臟和骨髓組織中擴(kuò)增到5個(gè)新的β-防御素基因，將測(cè)序結(jié)果與已發(fā)現(xiàn)的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳類動(dòng)物

2、β-防御索的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，這5個(gè)基因分別是鴨AvBD1、鴨AvBD3、鴨AvBD5、鴨AvBD6和鴨AvBD16。其中，鴨AvBD1 cDNA大小為198bp，編碼65個(gè)氨基酸，與鴕鳥AvBD1氨基酸同源性最高為78％；鴨AvBD3 cDNA大小為182bp，編碼60個(gè)氨基酸殘基，與雞AvBD3氨基酸同源性高達(dá)100%；鴨AvBD5 cDNA大小為201bp，編碼66個(gè)氨基酸殘基，與雞AvBD5氨基酸同

3、源性達(dá)97%；鴨AvBD6 cDNA大小為204bp，編碼67個(gè)氨基酸殘基，與雞AvBD6氨基酸同源性高達(dá)100%；鴨AvBD16 cDNA大小為155bp，編碼50個(gè)氨基酸，與雞AvBD3同源性最高，為62%。
　　 將這5個(gè)鴨AvBD基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。將表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，同時(shí)根據(jù)其各自的氨其酸序列分別合成相應(yīng)的5條多肽。以4種革蘭氏陽(yáng)性菌和8種革蘭氏

4、陰性菌為檢測(cè)菌，采用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定重組和合成的鴨AvBD1、3、5、6、16和GST蛋白的抗菌活性，以及鹽離子濃度對(duì)其抗菌活性的影響。并對(duì)這些蛋白的溶血活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，與GST標(biāo)簽蛋白相比，重組和合成鴨AvBD1、3、5、6和16蛋白對(duì)12種細(xì)菌均有顯著的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。在高鹽濃度下，這些蛋白對(duì)四聯(lián)球菌和多殺性巴氏桿菌的抗菌活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。此外，這些蛋白溶血活性極低，與陰性對(duì)照

5、相比，無(wú)顯著差異(P>0.05)。本試驗(yàn)還測(cè)定了這5個(gè)重組蛋白的體外抗鴨肝炎病毒作用，結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照(病毒組)相比，這些重組蛋白顯著延長(zhǎng)了鴨胚的存活時(shí)間(P<0.05或P<0.01)，相反地，GST無(wú)顯著作用(P>0.05)，表明這些重組蛋白具有抗鴨肝炎病毒的作用。
　　 為探討這些鴨AvBDs基因在體內(nèi)組織中的表達(dá)水平是否受鴨肝炎病毒誘導(dǎo)，及其抗病毒作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本研究以鴨肝炎病毒感染鴨，采用熒光定量PCR方法，分

6、別檢測(cè)了攻毒后24 h、32h、48 h、72 h、96 h鴨體內(nèi)法氏囊、脾臟、胸腺、盲腸扁桃體、骨髓、肝臟、腎臟和肺臟組織中這5個(gè)鴨AvBDs基因的表達(dá)量，以及幾個(gè)細(xì)胞因子：鴨白介素-2(IL-2)、白介素-18(IL-18)和γ干擾素(IFN-γ)，以及Toll樣受體7(TLR7)基因在除腎臟和肺臟外的上述組織中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，經(jīng)鴨肝炎病毒誘導(dǎo)后，除鴨AvBD1、3和IFN-γ在肝臟中沒(méi)有被誘導(dǎo)表達(dá)外，其余基因在肝臟組織中均被誘