hplc法同時(shí)測(cè)定水蠟樹果中齊墩果酸和熊果酸的含量

1、<p>　　HPLC法同時(shí)測(cè)定水蠟樹果中齊墩果酸和熊果酸的含量</p><p>　　【摘要】目的：建立同時(shí)測(cè)定水蠟樹果中提取液中的齊墩果酸和熊果酸含量的方法。方法：選用SHIMADZU C18柱（250mm ×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流動(dòng)相為甲醇：0.1%醋酸（pH=3.4）=94：6；流速為0.5ml?min-1；柱溫為20℃。結(jié)果：齊墩果酸進(jìn)樣量在2.24―6.72μg

2、范圍內(nèi)，熊果酸進(jìn)樣量在2.03―6.09μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】HPLC 水蠟樹果 齊墩果酸 熊果酸 含量測(cè)定 </p><p>　　一、材料、儀器與試劑 </p><p>　　（1）材料。水蠟樹果：采于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園內(nèi)，經(jīng)專家鑒定為水蠟樹果，經(jīng)陰干、低溫烘干處理為干品，放于干燥器內(nèi)備用。 </p><p&

3、gt;　?。?）儀器。高效液相色譜儀（真空脫氣機(jī)，進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器， SHIMADZU工作站）（LC-20A型日本島津），島津色譜柱（250mm×4.6mm，5μm ，C18）。索氏提取器（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司），電子天平（ESJ205-4型，沈陽龍騰電子有限公司），固體樣品粉碎機(jī)（XA-1型，金壇市恒豐儀器廠）。 </p><p>　?。?）試劑。甲醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；色譜純、超

4、純水、醋酸分析純（沈陽市新化試劑廠）；齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品（中國(guó)制藥生物制品檢定所）；乙醇分析純（沈陽市新化試劑廠）。 </p><p>　　二、試驗(yàn)方法與結(jié)果 </p><p>　?。ㄒ唬┧灅涔R墩果酸和熊果酸的提取 </p><p>　　將干燥的水蠟樹果用粉碎機(jī)粉碎，稱取10.000g，用濾紙包好，置于索氏提取器中，取95%的乙醇溶液100mL，先往索氏提取

5、器中加95%的乙醇至與虹吸管相平，剩余液體加入圓底燒瓶中，對(duì)樣品浸泡2h，然后在水浴鍋上加熱回流至無色，控制溫度在90℃左右。把回流液倒于100mL容量瓶中，超聲溶解，過濾，95%定容，得待測(cè)液，放于冰箱中待用。 </p><p><b>　?。ǘ┥V條件 </b></p><p>　　250mm×4.6mm的SHIMADZUC18色譜柱，填料粒度為5μm

6、；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流動(dòng)相為甲醇：0.1%醋酸（pH=3.4）=94：6；流速為0.5ml?min-1；柱溫為20℃。理論塔板數(shù)按齊墩果酸計(jì)不低于5000，按熊果酸計(jì)不低于4000。 </p><p>　?。ㄈR墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液的制備 </p><p>　　分別精密稱取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品22.40mg和20.30mg，分別置于25mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，

7、搖勻。取上述溶液各5mL，置于10mL容量瓶中，搖勻，0.25μm濾膜過濾，取濾液即得對(duì)照品混合溶液，其中齊墩果酸和熊果酸的濃度分別為0.448mg/mL和0.406mg/mL。 </p><p>　?。ㄋ模┧灅涔旋R墩果酸和熊果酸的檢測(cè) </p><p>　　取2.3的混合對(duì)照品溶液5μL和2.1提取液5μL（經(jīng)0.25μm濾膜過濾），按2.2色譜條件分別進(jìn)樣分析，平行進(jìn)樣5次，得色譜

8、圖。 </p><p>　　齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品的保留時(shí)間分別是17.737和18.892min，水蠟樹果提取液的色譜圖中有兩個(gè)色譜峰的保留時(shí)間分別是17.723和18.873min，根據(jù)在相同的色譜條件下保留時(shí)間相同的色譜峰是相同組分的原理，說明水蠟樹果中含有齊墩果酸和熊果酸。 </p><p>　?。ㄎ澹R墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 </p><p>　　精

9、密吸取混合對(duì)照品溶液5.0、7.0、9.0、10.0、13.0、15.0μL按2.2色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別以齊墩果酸和熊果酸的對(duì)照品的進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，組分峰面積值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程： </p><p>　　Y齊墩果酸=7.122×10-7X-0.0315，相關(guān)系數(shù)r=0.9999 </p><p>　　Y熊果酸 =8.560×10-7X-0.04

10、21，相關(guān)系數(shù)r=0.9996 </p><p>　　結(jié)果表明，齊墩果酸進(jìn)樣量在2.24～6.72μg范圍內(nèi)，熊果酸進(jìn)樣量在2.03～6.09μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 </p><p>　?。悠泛康臏y(cè)定 </p><p>　　取2.1制備的水蠟樹果提取液10μL（經(jīng)0.25μm濾膜過濾），平行進(jìn)樣5次，得色譜圖，根據(jù)回歸方程進(jìn)行計(jì)算水蠟樹果中齊墩果酸和熊果酸

11、的含量，齊墩果酸和熊果酸分別是10.84和21.65mg/g 。 </p><p><b>　?。ㄆ撸┓€(wěn)定性試驗(yàn) </b></p><p>　　取對(duì)照品溶液分別于配制后0、1、2、4、8、12、24h，取濾液5μL注入色譜儀，記錄色譜圖，考察溶液放置后峰面積的變化情況，齊墩果酸和熊果酸RSD分別為0.47%和0.25%，表明對(duì)照品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。 </p&g

12、t;<p><b>　?。ò耍┲噩F(xiàn)性試驗(yàn) </b></p><p>　　精密稱取水蠟樹果5份，按2.1方法進(jìn)行制備待測(cè)樣品溶液，進(jìn)樣10μL，按2.2色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，根據(jù)回歸方程分別計(jì)算齊墩果酸和熊果酸含量，齊墩果酸和熊果酸RSD分別為1.63%和1.78%，說明重現(xiàn)性較好。 </p><p>　?。ň牛┗厥章逝c精密度試驗(yàn) </p>

13、<p>　　為了考察方法的可靠性，進(jìn)行了回收率和精密度的測(cè)定。精密稱定水蠟樹果5份，每份0.100g，按2.1方法提取后分別精密加入齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品1.000mg，經(jīng)0.25μm濾膜過濾，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)結(jié)果算出回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。齊墩果酸加標(biāo)回收率在97.90%～100.10之間，RSD是0.817%，熊果酸加標(biāo)回收率在96.50～100.40之間，RSD是1.555%，說明方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。由此可

14、知該方法可行。 </p><p><b>　　三、討論 </b></p><p>　　（1）提取劑的選擇。本論文曾試用甲醇（60%、70%、80%、90%、無水甲醇）；乙醇（60%、70%、80%、95%、無水乙醇）為提取劑進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用95%乙醇的溶液進(jìn)行提取時(shí)，提取齊墩果酸和熊果酸的量最多，且回收率最好。 </p><p>　?。?）檢

15、測(cè)波長(zhǎng)的選擇。將齊墩果酸和熊果酸用流動(dòng)相分別配成待測(cè)溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～400nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明齊墩果酸和熊果酸在210nm處均有較強(qiáng)的吸收。因此，選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 </p><p>　　（3）流動(dòng)相的選擇。本論文考慮到齊墩果酸和熊果酸均為三萜類化合物，結(jié)構(gòu)非常相似，采用高效液相色譜法也很難將這兩種化合物分離開。發(fā)現(xiàn)，甲醇：0.1%醋酸（pH=3.4）=94：6作為流動(dòng)相時(shí)，齊墩果

16、酸和熊果酸分離情況很好。而其它流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)，分離效果很不好。因此，選擇甲醇：0.1%醋酸（pH=3.4）=94：6作為分析的流動(dòng)相。 </p><p>　?。?）齊墩果酸和熊果酸的提取溫度的選擇。本論文分別試用了在65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、100℃進(jìn)行樣品的提取，結(jié)果表明當(dāng)提取溫度高于90℃時(shí)，提取液中齊墩果酸和熊果酸的量顯著降低。因此，在提取的過程中應(yīng)注意溫度的控制，提取溫度最好不要高