畢業(yè)論文—sur1基因的組織定位

1、<p><b>　　摘要：</b></p><p>　　芥子油苷是一類十字花科植物所特有的硫代產(chǎn)物，芥子油苷代謝與植物防御反應(yīng)密切相關(guān)，且某些芥子油苷的降解產(chǎn)物具有很高的抗腫瘤活性，因而其代謝及調(diào)控機制的研究備受關(guān)注。隨著生物信息學的發(fā)展以及芥子油苷合成途徑中相關(guān)基因的鑒定，SUR1基因參與硫苷生物合成模式三個階段中硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成階段，SUR1表達的C-S lyase SUR1

2、 能將 S-烷基硫代烷肟轉(zhuǎn)換成硫代肟基酸。本研究以模式植物擬南芥為實驗材料。采用USER fusion，構(gòu)建載體，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，GUS染色等方式，觀察其表達模式，完成其組織定位，結(jié)果用以和其他已知的芥子油苷合成路徑中的一些相關(guān)的基因進行表達上的對比，通過這中方式探討SUR1基因在芥子油苷的合成途徑中的功能意義，以及SUR1基因時空表達的特異性。</p><p><b>　　關(guān)鍵詞：</b>&l

3、t;/p><p>　　芥子油苷,擬南芥,SUR1 ,USER fusion</p><p>　　Abstract: is a class of sulfur-containing secondary metabolism outcomes specialized in Cruciferous plants. Glucosinolates have an important role in pl

4、ant defense and some of the glucosinolates degradation products can prevent cancer in humans. Today, the researching about the glucosinolates metabolism and its biosynthesis regulation is under the spotlight. Along the d

5、evelopment of bioinformatics and the demonstration of the new genes which involve the biosynthesize of glucosinolates,，SUR1 take p</p><p>　　significance of the SUR1 gene in the&

6、#160;biosynthesis ofglucosinolates this way SUR1 gene temporal and spatial expression specificity.</p><p><b>　　Key word</b></p><p>　　Glucosinolates

7、 , Arabidopsis thaliana , SUR1 , USER fusion</p><p><b>　　1前言</b></p><p><b>　　1.1 研究背景</b></p><p>　　硫代葡萄糖苷即芥子油苷簡稱硫苷，是一種含氮、硫的化合物。芥子油苷廣泛分布于16 個不同科的雙子葉被子植物中, 它們分

8、別是十字花科( Brassicaceae) 、藜木科( Bataceae) 、鐘萼木科( Bretschneideraceae) 、白花菜科( Capparaceae) 、番木瓜科( Caricaceae) 、大戟科( Euphorbiaceae) 、環(huán)蕊科( Gyrostemonaceae) 、池花科( Limnanthaceae) 、辣木科(Moringaceae) 、瘤藥樹科( Pentadiplandraceae) 、商陸科(

9、Phytolaccaceae) 、海</p><p>　　桐花科( Pittosporaceae) 、木犀草科( Resedaceae) 、刺茉莉科( Salvadoraceae) 、烈味三葉草科( Tovariaceae)和旱金蓮科( Tropaeolaceae)[1]。最主要是存在于十字花科植物中，十字花科植物中超過350 個屬和3 000 個種都可以合成芥子油苷。是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物。芥子油苷既分布

10、于植物的生殖器官( 花序、角果/果實、種子) , 也存在于營養(yǎng)器官( 根、莖、葉) [2]。在同一植物中芥子油苷的含量和成分明顯依賴于株齡[3, 4]和組織器官而發(fā)生變化。近年來，由于其在黑芥子酶作用下的分解產(chǎn)物異硫代氰酸鹽在人體抗癌方面的健康功效而不斷受到大家的重視。增加食品中的芥子油苷含量和充分發(fā)揮其分解物的生物有效性已經(jīng)成為現(xiàn)今的一個研究熱點。芥子油苷一般貯存于植物細胞液泡中，而芥子酶貯存于特定的蛋白體中，一般情況下二者是分離的，

11、當植物組織受到病原體或蟲害侵襲時，細胞組織被破壞，芥子酶與硫苷相遇，發(fā)生反應(yīng)，將硫苷水解成異硫氰酸鹽（Isothiocyanates）、硫氰酸脂（Thiocyanates）和腈類（Nitriles）等降</p><p>　　芥子油苷通常由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團以及來源于氨基酸的側(cè)鏈R組成(圖1) 。</p><p>　　目前至少有120種不同的結(jié)構(gòu)被確定[ 5 ] 。根據(jù)側(cè)鏈的氨基

12、酸來源可以將芥子油苷分為脂肪族芥子油苷(側(cè)鏈來源于甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸) 、芳香族芥子油苷(側(cè)鏈來源于苯丙氨酸和酪氨酸)和吲哚族芥子油苷(側(cè)鏈來源于色氨酸) 3個類群。</p><p>　　硫苷生物合成模式大致可分為三個階段：氨基酸側(cè)鏈的延長、硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成和葡萄糖配基側(cè)鏈的二次修飾。硫苷的有無與含量的高低是由基因來控制的，相關(guān)的主要合成和調(diào)節(jié)基因參與硫苷合成的三個階段。氨基酸或氨基酸側(cè)

13、臉延長筒源無可經(jīng)由細胞色素P450(CYP450)家族的CYP79s(CYP79subfamily)和NADPH催化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的肟。肟形成后被CYP83s(CYP83subfamily)和NADPH催化產(chǎn)生不穩(wěn)定的酸式硝基化合物或氧化氰。二者均可與硫供體——半胱氨酸結(jié)合，在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶作用下生成S-烷基硫代烷肟，之后在C-S裂解酶的催化下生成的硫代肟基酸經(jīng)S—葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，與活化硫酸鹽的磺基結(jié)合形成芥子油苷的硫核心結(jié)構(gòu)，該

14、核心結(jié)構(gòu)之后再需要經(jīng)過羥基化、甲基化、去飽和化、磺化、葡萄糖基化等種種次級修飾形成不同的芥子油苷。</p><p>　　本研究所涉及的SUR1基因是在硫苷核心結(jié)構(gòu)的形成階段起重要作用：在硫苷核心結(jié)構(gòu)形成的階段中SUR1表達的C-S lyase SUR1 能將 S-alkylthiohydroximates（S-烷基硫代烷肟） 轉(zhuǎn)換成 Thiohydroximates（硫代肟基酸）[6]從而保證下一步反應(yīng)的進行(見

15、圖2)。本研究旨在完成該基因的組織定位。</p><p>　　圖2：脂肪族與吲哚族芥子油苷的生物合成路徑</p><p>　　1.2 USER fusion技術(shù)簡介</p><p>　　USER fusion技術(shù)的基礎(chǔ)理論是依賴于PCR引物的使用，該引物包含一個12-nt 5’尾部中至少含有四個脫氧胸腺嘧啶核苷（Ts）被替換成脫氧尿苷（Us），之后PCR產(chǎn)物被尿嘧啶

16、-DNA糖苷酶（uracil DNA glycosidase即UDG）處理，這種酶可以選擇性的切除尿嘧啶堿基，而保留磷酸二酯骨架的完好性，缺失的堿基位點會使堿基互補配對不穩(wěn)定。實驗結(jié)果中，引物的3’突出端在退火過程中同樣的在PCR擴增載體3’突出端互補配對。處理后的PCR產(chǎn)物和載體能形成一個可被轉(zhuǎn)入一個不需結(jié)扎的大腸桿菌之中的穩(wěn)定環(huán)狀雜交產(chǎn)物。隨著技術(shù)的發(fā)展，第二種酶被引入PCR產(chǎn)物的處理中——T4核酸內(nèi)切酶V，可以在3’端破壞DNA磷

17、酸二酯骨架制造一個脫堿基位點。因此，UDG和T4內(nèi)切核酸酶V連續(xù)作用在PCR產(chǎn)物中，與一個3’端含有單U殘基的引物一起，可以有效地被用于克隆。商用公司通過一種簡單的雙酶處理法將兩種酶混合到一起，稱為USERTM enzyme mix，并作出一定程度上的優(yōu)化改進。這種USER fusion技術(shù)被認為是一種高效率且通用性強的技術(shù)。[8]</p><p><b>　　2實驗材料與方法</b><

18、;/p><p>　　2.1 SUR1啟動子的克隆</p><p>　　啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，即啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，啟動子是基因的一個組成部分，控制基因表達的起始時間和表達的程度，本身不控制基因活動，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動的。一般認為

19、目的基因上游約2kb即包含目的基因啟動子片段，由于所需克隆的片段較長，故選擇USER fusion方法來克隆這段目的基因片段，這種方法通用性強，并且準確率和效率都比較高。</p><p>　　2.11 多聚酶鏈反應(yīng)擴增</p><p>　　包含SUR1啟動子全長cDNA的質(zhì)粒模板，寡核苷酸引物序列從Invitrogen公司購買， 依照說明書使用PfuTurbo CX Hotstart D

20、NA聚合酶行駛反應(yīng)。所涉及引物序列見表一（A、B）</p><p><b>　　引物 序列</b></p><p>　　SUR1啟動子FP 5′---GGCTTAAUTATTGCATTGCTACTTTGTGGTT----3′</p><p>　　SUR1啟動子RP 5′---GGTTTAAUCTTCTCTCTGTGCTTTGA

21、GTTCTT---3′</p><p>　　表一（A）SUR1啟動子引物</p><p>　　引物 序列</p><p>　　SUR1啟動子fusion FP1 5’---ATCTGGUATTAACTTGAAACTTTCACACTTCT----3’</p><p>　　SUR啟動子fusion RP1 5’--

22、-ACCAGAUTTTCATTACTTTCATTTAAAGTTCG----3’ </p><p>　　SUR1啟動子fusion FR2 5’---ATAGTCUAAAAATAGAAATTTGTTGACCAAG----3’</p><p>　　SUR1啟動子fusion RP2 5’---AGACTAUGGGTGCAAATGTTGTTTG----3’</p><p

23、>　　表一（B）SUR1啟動子USER fusion 引物</p><p>　　2.12 DNA純化</p><p>　　根據(jù)廠家說明書用QIAquick PCR純化工具對PCR產(chǎn)物進行柱相純化，純化產(chǎn)物以原體系的三分之一的蒸餾水進行洗脫。</p><p>　　2.13 純化的PCR產(chǎn)物與預(yù)備載體的結(jié)合</p><p>　　等體積的純化

24、PCR產(chǎn)物連同等體積的帶有PacI/Nt.BbvCI的預(yù)備載體pCambia3300一起，于瓊脂糖凝膠上進行跑膠，通過條帶亮度分析相對濃度，決定混合配比3:3:3:1 。</p><p>　　2.14 用USERTM enzyme mix處理</p><p>　　一微升10 TE buffer【100mM Tris-HCl, 1mMEDTA (pH 8.0)】、1U 的 USERTM en

25、zyme mix(1U/μL)加到8 μL預(yù)備載體和PCR純化產(chǎn)物的混合物，反應(yīng)在37℃的溫度下孵育20分鐘，接著在25℃的條件下反應(yīng)20分鐘，預(yù)備載體在反應(yīng)混合物中的量大概占 0.01 pmol.</p><p><b>　　2.15 轉(zhuǎn)化</b></p><p>　　全部10μL的反應(yīng)混合物與50μL感受態(tài)大腸桿菌細胞進行熱激反應(yīng)</p><p

26、>　　2.16 質(zhì)粒的準備與限制性分析</p><p>　　依照廠家說明書，使用GenEluteTM 質(zhì)粒小量制備工具，4ml過夜培養(yǎng)，被純化的質(zhì)粒用50μL的水洗脫，在一個20μL包含1 NEB Buffer 2[50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM dithiothreitol (pH 7.9)]和100μL/ml BSA的反應(yīng)體系中每兩微升質(zhì)粒用10U的S

27、peI,37℃條件下切割2小時。</p><p>　　在含有卡那霉素固體培養(yǎng)基中篩選，PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒，取陽性克隆菌落。</p><p><b>　　載體示意圖如圖3</b></p><p><b>　　圖3：載體示意圖</b></p><p>　　所構(gòu)建載體為二元載體，Basta為在植物體

28、中的篩選標記，Kana為菌體中的篩選標記。所連接的GUS基因用于后續(xù)組織定位之用。</p><p><b>　　2.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌</b></p><p>　　重組表達載體導人農(nóng)桿菌。用電轉(zhuǎn)化法將重組表達載體導入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2 500 kV／em；電容25 F；電阻500 Q。電擊3～5 ms后，取出電擊杯，迅速加入800 L的LB液體培養(yǎng)基

29、，混勻并轉(zhuǎn)移至1．5 mL的EP管中，在28℃震蕩培養(yǎng)3 h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50／,g／mL)的LB平板中28℃培養(yǎng)24 h，即可長出陽性克隆。</p><p>　　陽性克隆的菌落PCR與酶切鑒定。隨機挑取單菌落，在裝有1 mL的LB和1．5 mL的抗生素的離心管中28℃培養(yǎng)12 h左右。取5O L培養(yǎng)物，煮沸5 rain，5 000 r／rain離心2 min，取

30、1～2／,L上清進行PCR擴增后電泳檢測。選取菌落PCR驗證后的菌液抽提質(zhì)粒，并用BstE 1I和Bgl 1I雙酶切后，電泳檢測。</p><p>　　2.3 農(nóng)桿菌浸染法侵染擬南芥</p><p><b>　　前期準備：</b></p><p>　　取150ml 含相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基，接入2-3ml準備好的農(nóng)桿菌菌液，大搖過夜至培養(yǎng)基

31、由紅色轉(zhuǎn)為黃色。將培養(yǎng)后的150ul農(nóng)桿菌菌液導入滅過菌的50ml離心管中，4℃，3000rmp離心15min棄上清，加入50ml 1／2 MS，將菌泥攪起。</p><p>　　用于侵染的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）</p><p><b>　　MS大量 5 ml</b></p><p>　　蔗糖

32、 10 g</p><p>　　水 95 ml</p><p>　　表面活性劑 20 ul</p><p>　　常用1／2 MS配方（1L）：</p><p>　　10X大量元素 50 ml</p><p>　　100X微量元素 5 ml</p><p>　　100X鐵鹽

33、 5 ml</p><p>　　蔗糖（1%） 10 g</p><p>　　瓊脂粉 8 g</p><p><b>　　擬南芥生長土壤：</b></p><p>　　腐殖土：蛭石=1:1混勻，裝雙層袋子，高壓121℃滅菌40分鐘</p><p>　　注意：滅完菌后要

34、加適量水將土和濕，不能太濕，然后土裝入缽里壓實，將缽放入裝有水的底盤中，一個小時左右缽中土壤浸濕后便能種苗。</p><p><b>　　種子消毒：</b></p><p>　　30%H2O2+85%乙醇 1:4混合</p><p>　　取250微升混合液加入種子種用槍頭吹打40S，放在濾紙上晾干，然后鋪在1／2 MS平板上。4℃冰

35、箱中放置春花1-5天，一般新種子春花時間長點。16\8 光周期，待真葉長出時，用鑷子將苗從平板移植到土壤中。</p><p><b>　　后續(xù)操作</b></p><p>　　1 種植健康的擬南芥直到開花。在種子種下后澆水蓋膜，蓋膜的目的是為了保持水分。移栽擬南芥后還需要蓋3到4天的膜。</p><p>　　2 初次開花時將花蕾剪掉以促進更多花

36、枝的增生，修剪后越4至5天可使用，這樣優(yōu)化后的植物含有很多未成熟的花序并沒有很多受精的角果，以保證大多數(shù)植物被成功的轉(zhuǎn)化。</p><p>　　3準備攜帶目的基因在雙元載體（雙元載體有兩套篩選引子，菌體中用一種，植物中用一種）里的農(nóng)桿菌菌株。養(yǎng)殖在一個大的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基帶有抗生素，以為篩選二元質(zhì)粒。</p><p>　　4 搖床搖農(nóng)桿菌，用5%的蔗糖溶液（蔗糖溶液中加入表明活性劑

37、，達到濃度0.05%）混懸到OD600 = 0.8（左右）把100ml的5﹪的蔗糖懸浮的菌液倒入大皿內(nèi)，然后把擬南芥的花序浸入進去侵染2分鐘，侵染的過程要轉(zhuǎn)動缽子，（侵染之前一晚上最好給缽子里澆些水，以免第二天侵染后缽子里的土容易掉出來），侵染后用濾紙擦干。</p><p>　　5 侵染后的擬南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆蓋，暗培養(yǎng)24小時后繼續(xù)光照。侵染后悉心照料，保持水分充足。一周后可再侵染一次，這是由于擬南芥的

38、盛花期較長，一般要侵染2—3次。</p><p>　　6 澆水松土正常養(yǎng)殖，種子成熟后停止?jié)菜?lt;/p><p>　　7 角果自然開裂后收獲干燥的種子，獨立分裝備用。</p><p>　　2.4 Basta篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥</p><p>　　收獲后的干燥種子經(jīng)表面消毒，放于4℃冰箱，春化4天后，播種于培養(yǎng)土中，待長出2片真葉后，噴灑1：1

39、000的Basta除草劑進行篩選。設(shè)計特性引物，采用RT_PcR方法對具有Basta抗性的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定。</p><p><b>　　3 實驗結(jié)果</b></p><p>　　3.1 SUR1啟動子USER fusion 克隆結(jié)果（圖4）</p><p>　　SUR1啟動子分割成三段的PCR擴增結(jié)果凝膠電泳圖，Marker均為200

40、0bp,從上至下依次為：2000、1000、750、500、250、100</p><p><b>　　M </b></p><p>　　SUR1啟動子第一段</p><p><b>　　M</b></p><p>　　SUR1啟動子第二段</p><p><

41、b>　　M</b></p><p>　　SUR1啟動子第三段</p><p>　　圖4： 擴增條帶顯示，SUR1啟動子克隆第一段約800bp左右，第二段越600bp左右，第三段越600bp左右，三段合約2000bp，所得片段與預(yù)期一致。</p><p>　　3.2 啟動子PCR產(chǎn)物與載體的連接</p><p>　　通過條帶亮

42、度計算出連接體系</p><p><b>　　總體系12 ul</b></p><p>　　1 ul 4號酶切質(zhì)粒</p><p>　　3 ul SUR1啟動子第一段</p><p>　　3 ul SUR1啟動子第二段</p><p>　

43、　3 ul SUR1啟動子第三段</p><p>　　1 ul USERTM enzyme</p><p>　　1 ul 無菌水</p><p>　　3.3 大腸桿菌中SUR1啟動子菌落PCR檢測結(jié)果</p><p>　　經(jīng)卡那霉素篩選，得到陽性克隆，對其進行菌落PCR檢測。<

44、/p><p>　　M 1 2 3</p><p>　　圖5：Marker為2000bp,從上至下依次為：2000、1000、750、500、250、100</p><p>　　1號為空白對照，2、3號為挑取的單菌落。3號菌落經(jīng)電泳結(jié)果顯示為假陽性。</p><p>　　SUR1啟動子第一段 S

45、UR1啟動子第二段 SUR1啟動子第三段</p><p><b>　　SUR1啟動子</b></p><p>　　圖6：重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖</p><p>　　為印證連接正確并成功導入大腸桿菌，SUR1啟動子的第二段出于連接的中心，對SUR1啟動子第二段進行PCR擴增，如未被導入或連接錯誤能得不到與之前（圖5）一致的結(jié)果，所得結(jié)果約6

46、00bp，與之前圖5結(jié)果一致，證明三段啟動子均被轉(zhuǎn)入并連接正確。</p><p>　　對重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明編碼序列與預(yù)期一致。</p><p>　　3.4 SUR1啟動子農(nóng)桿菌的PCR檢測</p><p>　　對上述測序過的大腸桿菌進行提取質(zhì)粒，重組表達載體導入農(nóng)桿菌，挑取陽性菌落對其進行菌落PCR凝膠電泳，擴增SUR1啟動子的第二段，原理同結(jié)果3.3。&l

47、t;/p><p>　　M 1 2</p><p>　　圖7：M為Marker，2000bp,從上至下依次為：2000、1000、750、500、250、100 1、2為挑取的單菌落</p><p>　　結(jié)果表明大小約600bp，與預(yù)期結(jié)果相符，證明重組表達載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。</p><p>　　3.5 Basta

48、篩選結(jié)果</p><p>　　用濃度為1：1 000的Basta除草劑噴灑四葉期的幼苗進行篩選，未轉(zhuǎn)化成功的幼苗由于不含抗Basta除草劑基因而枯萎變黃被殺死；成活的即為轉(zhuǎn)化成功的幼苗。</p><p><b>　　(B)</b></p><p>　　圖8 進行Basta篩選之前</p><p>　?。ˋ）為轉(zhuǎn)基因幼苗，

49、（B）為野生型空白對照</p><p>　　（A） （B）</p><p>　　圖9 進行Basta篩選之后</p><p>　　為轉(zhuǎn)基因幼苗，（B）為野生型空白對照 </p><p>　　可以看出，（B）組野生型全部被Basta殺死，枯萎變黃，（A）組部分幼苗由于未被轉(zhuǎn)化成功，

50、不含抗Basta基因，遂也被殺死，枯萎變黃。剩余有Basta抗性即存活下去者即為被轉(zhuǎn)化成功的幼苗。</p><p><b>　　4討論：</b></p><p>　　本研究利用了USER fusion技術(shù)以擬南芥基因為基因模板克隆出SUR1的啟動子基因，并選用pCambia 3300 為載體，成功的將SUR1啟動子構(gòu)建到CAMV35S啟動子的下游，通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿

51、菌、農(nóng)桿菌侵染植物等步驟將下游連接GUS基因的SUR1啟動子轉(zhuǎn)入擬南芥中，對其進行組織定位的研究。轉(zhuǎn)錄的起始，是基因表達的關(guān)鍵階段，影響基因表達的水平，一般認為目的基因上游約2kb即包含目的基因啟動子片段，由于所需克隆的片段較長，本研究選用USER fusion技術(shù)來完成這段目的基因的克隆。USER fusion是一種快捷而高效的方法，可以同時對復(fù)雜的PCR產(chǎn)物進行融合和克隆。由于本研究所涉及的SUR1啟動子，所需克隆的基因長度達200

52、0bp，對這種長度的基因，傳統(tǒng)的PCR方法難以克隆出準確的目的基因，并且酶的效率也會變低。但通過USER fusion技術(shù)將片段分割成三部分同時分別克隆并在融合酶的作用下按原序列融合在一起。從而得到了較長目的基因——SUR1啟動子的克隆產(chǎn)物。USER fusion是一種簡單、快速、高效的技術(shù)，用以一步完成合成和克隆多重PCR產(chǎn)物到載體之中。大大的節(jié)約了時</p><p>　　SUR1組織定位的意義</p&g

53、t;<p>　　和其他已知的芥子油苷合成路徑中一些相關(guān)的基因的表達特異性進行對比，可以清楚的了解SUR1基因在芥子油苷合成途徑中的功能意義，以及SUR1基因時空表達的特異性。由于時間并未進行到對其的GUS染色處理，進一步的實驗分析將在后續(xù)實驗中繼續(xù)進行討論。</p><p><b>　　5參考文獻</b></p><p>　　[1] Fahey JW,

54、Zalcmann AT, Talalay P.Phytochem, 2001, 56( 1) : 5～51.</p><p>　　[2] Halkier BA, Du LC.Trends Plant Sci, 1997, 11( 2) : 425～431.</p><p>　　[3] Lykkesfeldt J, M!ller BL.Plant Physiol, 1993, 102( 2)

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58、gt;　　[8] USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products,Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 7 e55</p><p><b>　　致謝：</b></p><

59、;p>　　感謝全體實驗室同仁！李晶導師淵博的專業(yè)知識，嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度，精益求精的工作作風，誨人不倦的高尚師德，嚴以律己、寬以待人的崇高風范，樸實無華、平易近人的人格魅力對我影響深遠。不僅使我樹立了遠大的學術(shù)目標、掌握了基本的研究方法，還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。本論文從選題到完成，每一步都是在李晶導師和師兄孔穩(wěn)穩(wěn)的指導下完成的，傾注了大量的心血。在此，謹向?qū)熂皫熜直硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x! 本論文的順利完成，離不