人志賀菌對(duì)雛雞的致病性及人、雞志賀菌某些重要基因的比較研究.pdf

1、菌痢是由志賀菌引起的一種在全球范圍流行的急性腸道傳染病，尤其是發(fā)展中國家的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。志賀菌除可感染人引起痢疾外，還可造成多種動(dòng)物感染、發(fā)病。2004年許蘭菊等首次發(fā)現(xiàn)雞志賀菌感染病例，但其與人志賀菌之間的關(guān)系尚不清楚。為進(jìn)一步了解志賀菌尤其是雞鮑氏志賀菌的分子生物學(xué)特性、致病性及其致病性的分子機(jī)制，以便弄清雞鮑氏志賀菌的來源及其在公共衛(wèi)生方面的意義，本文進(jìn)行了下列研究并取得預(yù)期結(jié)果： 1.用不同劑量的雞鮑氏、人鮑氏

2、和人福氏志賀菌通過腹腔注射人工感染1日齡雛雞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)后兩者均能引起雛雞發(fā)病和死亡，且有拉血痢的典型癥狀出現(xiàn)。證明人志賀菌可人工感染雛雞并引起發(fā)病死亡。 2.用不同劑量的人福氏志賀菌對(duì)雛雞做同居感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示102個(gè)菌即可以引起雛雞20％的發(fā)病。各人工感染試驗(yàn)組和同居自然感染雛雞均有不同程度的病變發(fā)生，剖檢病變率達(dá)到10096。從各試驗(yàn)組雛雞體內(nèi)都回收到了原接種的菌株。由此證明人志賀菌不僅可以感染雛雞還能造成水平傳播，并且在

3、此過程中其毒力大質(zhì)粒不會(huì)很快丟失。此外還發(fā)現(xiàn)雞體可以做為志賀菌的儲(chǔ)存宿主，而且志賀菌對(duì)雞的感染與對(duì)人的感染存在相類似的情況，即隨著年齡的增長對(duì)志賀菌的抵抗能力增強(qiáng)。本研究不僅為雞志賀菌的來源及人一雞志賀菌之間的關(guān)系提供了間接證據(jù)，而且證明人禽之間存在交叉感染的可能性。 3.將人福氏志賀菌的毒力大質(zhì)粒與丟失此質(zhì)粒的雞志賀菌通過體外培養(yǎng)的方式，可使該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到丟失自身毒力大質(zhì)粒的雞志賀菌中。用不同劑量的毒力大質(zhì)粒轉(zhuǎn)移菌株通過口服和腹

4、腔注射分別人工感染雛雞和小白鼠，結(jié)果顯示感染雛雞最高發(fā)病率為80％，小鼠最高為60％；雖均無死亡，但剖檢病變率達(dá)100％。從試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)分別回收到原接種菌株。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)志賀菌丟失毒力大質(zhì)粒后其培養(yǎng)特性發(fā)生較大改變，重新獲得毒力大質(zhì)粒則能恢復(fù)其大部分培養(yǎng)特性。本研究首次發(fā)現(xiàn)人志賀菌毒力大質(zhì)?？梢栽隗w外轉(zhuǎn)移給雞志賀菌，且新生成的轉(zhuǎn)移菌株具有一定穩(wěn)定性和致病性。據(jù)此推測在適宜的外界環(huán)境中只要有毒力大質(zhì)粒和丟失毒力大質(zhì)粒的相近病原菌存在，

5、兩者就可能會(huì)發(fā)生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生一株新的完整的致病菌株。 4.通過藥敏試驗(yàn)檢測了雞和人鮑氏志賀菌、人福氏志賀菌對(duì)12種常用抗生素的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)三株志賀菌均未產(chǎn)生對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性。根據(jù)已發(fā)表的序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增三株志賀菌的gyrA基因和parC基因，并對(duì)其中的耐喹諾酮類決定區(qū)(QRDR)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)雞鮑氏和人鮑氏志賀菌的QRDR區(qū)的序列沒有發(fā)生任何堿基的突變，這與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相吻合。而人福氏志賀菌的gyrA基因中

6、卻存在83位Ser83(TCG)→Leu(TTG)的突變，由于只有該位點(diǎn)發(fā)生了突變，所以還沒有出現(xiàn)耐藥性表征，這與細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥需同時(shí)存在GyrA和ParC多個(gè)位點(diǎn)突變或其它耐藥機(jī)制的觀點(diǎn)一致；同時(shí)在其parC基因中存在58位Ser58(AGc)→Ile(ATC)的突變，該突變點(diǎn)雖與常見的80、84位氨基酸的改變有所不同，卻仍在QRDR區(qū)域之中。雖然暫時(shí)還無法根據(jù)這一結(jié)果來判斷該突變與喹諾酮類耐藥性之間的關(guān)系，但至少表明該菌株正處在

7、耐藥性演變進(jìn)程之中。其在志賀菌耐藥性形成中的確切作用還有待進(jìn)一步研究。 5.利用PCR技術(shù)成功地獲取了雞鮑氏志賀菌ipaH基因的6個(gè)拷貝片段，并對(duì)其進(jìn)行了序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)雞鮑氏志賀菌與美國報(bào)道的人鮑氏菌株CP001063在6個(gè)拷貝片段的核苷酸序列比較中同源性都是最高的；與國內(nèi)報(bào)道的人鮑氏菌株CP000036在6個(gè)拷貝片段的核苷酸序列同源性比較中雖然存在差異，但與除ipaH_2之外的5個(gè)片段的同源性僅次于CP001063。這一

8、結(jié)果更進(jìn)一步顯示了雞鮑氏志賀菌起源于人鮑氏志賀菌的可能性。此外還選擇了人鮑氏和福氏志賀菌的ipaB和ipaC基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其進(jìn)行克隆測序分析。結(jié)果表明人鮑氏志賀菌(B株)的ipaB基因與已發(fā)表的相應(yīng)序列的同源性為98.3％～99.9％，ipaC基因與已發(fā)表的相應(yīng)序列的同源性為97.8％～100.0％；人福氏志賀菌(F株)的ipaB基因與已發(fā)表的相應(yīng)序列的同源性為98.1％～99.5％，ipaC基因與已發(fā)表的相應(yīng)序列的同源性為97.9