人源志賀菌對SPF雛雞、雞腸上皮原代細胞的侵襲性及腸組織CD44分子的時空性表達研究.pdf

1、志賀菌為革蘭陰性兼性細胞內(nèi)致病菌,臨床上可以引起人細菌性痢疾。許蘭菊、王川慶等于2004年首次報道了雞志賀菌病例,主要以雛雞膿血痢為特征。對我國部分地區(qū)有不同程度腹瀉病史的雞群進行志賀菌感染血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),雞志賀菌血清抗體陽性率達28.3％-33.7％。病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該致病菌在生物學(xué)及血清學(xué)特性等方面與人源志賀菌完全相同。通過對細菌的管家基因及基因組分析結(jié)果可知,雞志賀菌與人源菌同源性極高,是與人志賀菌密切相關(guān)的或是他們的亞種,從

2、整個基因水平上看,雞志賀菌可能起源或來源于人志賀菌。為此,本文針對人志賀菌對雞的致病性及致病機制開展了初步研究。
　　 作者通過生化試驗、血清學(xué)試驗、豚鼠角膜試驗、小鼠攻毒試驗、PCR方法對7株病人臨床腹瀉樣品分離菌株進行了鑒定。在此基礎(chǔ)上,對分離株毒力基因ipaH、ipaB、ipaC、setlA、sen進行擴增,研究志賀菌質(zhì)粒在傳代中的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示ZD01、ZD02菌株為福氏志賀菌,豚鼠角膜試驗呈陽性,可以致死小鼠,且均可

3、檢測到毒力基因ipaH、ipaB、ipaC、set1A、sen。毒力基因傳代結(jié)果顯示ZD01、ZD02志賀菌分別在連續(xù)傳代至22代次、26代次后出現(xiàn)毒力基因缺失。人源ZD01、ZD02志賀菌菌株的獲得為后續(xù)試驗提供了基礎(chǔ)材料。
　　 為了解人源志賀菌對雛雞的致病性,分別選取3日齡的SPF雞作為志賀菌攻毒試驗的體內(nèi)感染模型；選取雞胚腸組織原代細胞作為體外感染模型。雛雞體內(nèi)攻毒試驗表明志賀菌的半數(shù)致死量為腹腔注射0.85×106個細

4、菌,口服感染不引起雛雞死亡,腹腔注射6 h后在心、肝、脾、肺組織中均可分離回收到志賀菌,18 h在肺臟中達到最高峰。體外感染試驗電鏡觀察在腸組織原代上皮細胞胞質(zhì)中可見志賀菌的存在。以上試驗說明人源志賀菌腹腔注射可以引起雛雞發(fā)病,并且在體外可侵襲雞胚腸組織原代上皮細胞。
　　 為進一步了解人源志賀菌對雞胚腸組織原代上皮細胞的侵袋機制,選取CD44分子作為研究對象。首先鑒定CD44分子在雛雞腸組織原代上皮細胞是否表達,為此設(shè)計特異性

5、引物,建立反轉(zhuǎn)錄PCR方法進行CD44 mRNA的擴增；為進一步了解CD44的時空表達特性,建立了定量檢測雞CD44基因和GAPDH基因mRNA表達水平的SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT—PCR方法,并采用該方法對1-28日齡商品雞雞腸組織原代上皮細胞中CD44 mRNA表達水平進行了檢測。結(jié)果顯示:雞腸組織原代上皮細胞中可以擴增到CD44 mRNA,所建立的熒光定量方法的擴增效率分別為95％和101％;線性范圍均在108-104