志賀菌中CRISPR的分布及其結(jié)構(gòu)特征.pdf

1、志賀菌屬細(xì)菌是急性感染性腹瀉的主要病原體之一，由志賀菌引起的細(xì)菌性痢疾的發(fā)病率居我國感染性腹瀉病首位。隨著抗生素的廣泛使用，志賀菌的耐藥現(xiàn)象越來越普遍，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的主要方式之一。
　　成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)菌橫向基因轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的一個(gè)遺

2、傳結(jié)構(gòu)，能夠有效地防御基因的水平轉(zhuǎn)移。因此了解細(xì)菌中CRISPR的存在與否及其特征，對(duì)于探討細(xì)菌耐藥狀況及其機(jī)制，尤其了解細(xì)菌橫向基因轉(zhuǎn)移情況具有重要意義。而CRISPR在志賀菌中的分布情況未見報(bào)道。
　　本課題檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存的志賀菌CRISPR系統(tǒng)相關(guān)基因并測(cè)序，分析志賀菌中CRISPR的分布情況及其特征，為進(jìn)一步揭示志賀菌橫向基因轉(zhuǎn)移規(guī)律及其與細(xì)菌耐藥等特性的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。
　　研究方法：
　　對(duì)196株志賀菌

3、進(jìn)行生化鑒定，其中江西分離株9株，河南分離株176株，北京分離株5株，中國藥品檢定所6株;K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn);PCR擴(kuò)增志賀菌CRISPR相關(guān)序列;DNA測(cè)序，并對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析;采用隨機(jī)引物法標(biāo)記制作探針，斑點(diǎn)雜交。
　　結(jié)果：
　　1.在196株志賀菌株中均檢測(cè)出cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因。以志賀菌分離時(shí)間的中位數(shù)2004年為分界點(diǎn)分為兩組，其中CRISPR-S1、CRISPR-S4在

4、兩組之間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而CRISPR-S2、CRISPR-S3在兩組的分布沒有差異。
　　2.在90株志賀菌中共檢出260條間隔序列，與CRISPRDB數(shù)據(jù)庫比對(duì)，207條是已有的志賀菌間隔序列，另外53條是新發(fā)現(xiàn)的志賀菌間隔序列。
　　3.志賀菌CRISPR同一個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)序列相對(duì)保守，有的重復(fù)序列在5′端或3′端會(huì)出現(xiàn)堿基缺失和變異。
　　4.BLAST發(fā)現(xiàn)與cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas

5、2基因高度同源的細(xì)菌包括志賀菌和大腸桿菌。志賀菌CRISPR系統(tǒng)的重復(fù)序列和間隔序列在CRISPRDB數(shù)據(jù)庫BLAST，與大腸桿菌、沙門氏菌中甚至一些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株同源性較高。
　　5.選取3株志賀菌進(jìn)行cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的含有CRISPR的Shigellasonnei53G進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)cas1(a)基因、casl(b)基因和cas2基因均有不同程度的差異

6、，進(jìn)一步做藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)cas2基因的差異和細(xì)菌耐藥程度存在關(guān)聯(lián)。
　　6.設(shè)計(jì)出志賀菌cas基因和重復(fù)序列探針，地高辛標(biāo)記后與志賀菌基因組DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，產(chǎn)生雜交信號(hào)。
　　結(jié)論：
　　1.CRISPR系統(tǒng)在志賀菌中廣泛存在;不同時(shí)間分離的志賀菌的CRISPR位點(diǎn)S1和S4分布有差異。
　　2.Cas2基因差異與志賀菌耐藥程度有關(guān)。
　　3.志賀菌CRISPR系統(tǒng)與大腸桿菌的同源性較高。
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