豬屠宰產(chǎn)品中HEV攜帶情況調(diào)查及大鼠感染模型的建立.pdf

1、戊型肝炎病毒(HEV)是一種經(jīng)糞－口途徑傳播的人獸共患病病原體。大量的研究表明豬是HEV的天然宿主，雖然HEV感染并不引起豬明顯的臨床癥狀，但HEV正是通過(guò)這種天然宿主大量復(fù)制儲(chǔ)存，從而感染人類，給人類公共衛(wèi)生帶來(lái)潛在的威脅。本研究提出了一種豬HEV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，利用該方法對(duì)豬屠宰產(chǎn)品中HEV的攜帶情況進(jìn)行了調(diào)查并建立了SD大鼠HEV感染模型。該研究為動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫相關(guān)部門(mén)對(duì)豬HEV的監(jiān)測(cè)、診斷等提供了技術(shù)支持和基本理論依據(jù)。

2、 一、豬HEV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立 目前戊型肝炎主要是通過(guò)ELISA（酶聯(lián)免疫）法檢測(cè)HEV抗體進(jìn)行診斷，但HEV感染窗口期、患者自身免疫體制以及ELISA試劑本身等多方面原因給戊肝的診斷帶來(lái)了難度。HEV RNA 檢測(cè)是判斷HEV病毒是否存在的標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究采用了兩種PCR檢測(cè)方法檢測(cè)豬HEV RNA。根據(jù)GenBank中已提交的豬HEVORF2特異性片段設(shè)計(jì)套式簡(jiǎn)并引物，成功地建立了實(shí)驗(yàn)室豬HEV RNA RT-nPCR檢

3、測(cè)方法。結(jié)果表明該方法具有高度的特異性和敏感性，可用于豬屠宰產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。同時(shí)，根據(jù)GenBank中提交的豬HEVORF3特異性片段設(shè)計(jì)引物，建立了豬HEV的Taq Man探針熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法具有簡(jiǎn)便快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。 二、生豬屠宰產(chǎn)品HEV攜帶情況調(diào)查 本研究從上海地區(qū)屠宰場(chǎng)采集了120份豬膽汁、120份豬肝臟、120份豬脾臟、120份豬腸系膜淋巴結(jié)、126份豬糞便、123份豬血液總共729份樣品，

4、利用建立的RT-nPCR方法，對(duì)樣品中的HEV RNA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增子進(jìn)行T-A克隆測(cè)序，對(duì)獲得的序列進(jìn)行了病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明屠宰場(chǎng)生豬攜帶的HEV存在于膽汁、血清及糞便樣品中。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示上海屠宰場(chǎng)生豬產(chǎn)品HEV既有基因3型又有基因4型HEV毒株。該結(jié)果提示，屠宰場(chǎng)必須妥善處理屠宰時(shí)產(chǎn)生的血清、膽汁和糞便，以防HEV污染其它屠宰產(chǎn)品。 三、豬HEV大鼠感染模型的建立 本研究用HEV陽(yáng)性的豬糞便上清液

5、經(jīng)尾靜脈接種SPF SD大鼠，通過(guò)Taq Man探針熒光定量PCR方法檢測(cè)HEV RNA，采用間接免疫熒光觀察HEV病原在大鼠不同組織中的動(dòng)態(tài)分布情況，同時(shí)利用組織病理切片觀察攻毒后大鼠不同組織的病理變化。大鼠感染HEV后癥狀比較明顯，在肝臟、脾臟、淋巴結(jié)中可觀察到HEV抗原，在血清、糞便中能檢測(cè)到HEV RNA，肝、脾、淋巴結(jié)出現(xiàn)病理變化，并在感染后期能檢測(cè)到HEV抗體，但血清ALT活性沒(méi)有一致性提升。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中TBIL水平一直