家養(yǎng)牛STR分型技術及其法醫(yī)學應用.pdf

1、隨著法庭科學、動物遺傳學和基因組學的發(fā)展，對家養(yǎng)牛進行DNA分析的需求逐漸增加。短串聯(lián)重復序列(short tandem repeats，STR)具有雜合度高，多態(tài)性好，易于檢測，利于實現(xiàn)分型標準化和自動化等優(yōu)點，成為家養(yǎng)牛DNA分析最常用的工具。但由于牛STR分析技術出現(xiàn)時間短，在遺傳標記選擇和實驗方法等方面均尚存在一些缺陷，未能滿足司法鑒定實踐的需要。 為建立能有效進行家養(yǎng)牛個體識別和親子鑒定的DNA遺傳標記體系，本實驗擬在

2、家養(yǎng)牛常染色體基因組范圍內篩選四核苷酸STR基因座，并對其進行遺傳多態(tài)性分析。 首先在文獻和公共數(shù)據(jù)庫中查找牛四核苷酸STR基因座，同時應用Tandem repeats finder(TRF)軟件在牛29條常染色體基因組DNA序列中搜索重復單位長度為4bp，完整重復次數(shù)在8個或以上且不含插入缺失的STR，結果共查找到187個牛四核苷酸STR基因座。應用PrimerPremier5.0軟件為查找到的基因座設計引物，參數(shù)設置為：產物

3、長度<450bp，引物長度15-27個堿基，不含二級結構和發(fā)卡結構，引物之間無互補序列存在。共有30個基因座的鄰近序列滿足引物設計要求。利用40份無關家養(yǎng)牛樣本對這30個基因座進行篩選，剔除擴增效率低、有明顯陰影帶或遺傳多態(tài)性低的基因座后，最終得到7個分型清晰的四核苷酸STR基因座。 對100份無關家養(yǎng)牛樣本進行這7個STR基因座的電泳分型檢測，明確它們的等位基因并進行測序，根據(jù)ISFG的命名規(guī)則為各個等位基因命名。在GenBa

4、nk和BLAST數(shù)據(jù)庫中，搜索這7個STR基因座的序列，除基因座G18833外，確定其余6個STR基因座未經報道過。將基因座的信息提交給GenBank，獲得這6個基因座的收錄號并以此對其分別進行命名為FJ232022、FJ232028、FJ232023、FJ232024、FJ232026和FJ23205。分別制備7個基因座的等位基因分型標準物(Ladder)，通過與Ladder比對獲得100份家養(yǎng)牛樣本的基因型資料。利用GENEPOP程

5、序進行Hardy—Weinberg平衡檢驗和連鎖不平衡(linkagedisequilibrium，LD)檢驗。7個基因座的等位基因頻率、個體識別能力(discriminationpower，DP)、多態(tài)性信息含量(polymorphisminformationcontent，PIC)和雜合度觀察值(observedheterozygosity，Ho)通過Modified—Powerstates軟件計算得到。應用PowerMaker軟件

6、統(tǒng)計各基因座的基因型頻率。按文獻報道的公式計算雜合度期望值(expectedheterozygosity，He)、非父排除概率(probabilityofexclusion，PE)、累積個體識別能力(TDP)和累積非父排除概率(CPE)。7個STR基因座在100份無關家養(yǎng)牛群體樣本中分別檢出4～12種等位基因和6～27種基因型。7個基因座的基因型數(shù)據(jù)均通過了Hardy—Weinberg平衡檢驗(P>0.05)。獨立性檢驗證實7個基因座之

7、間均無明顯關聯(lián)，處于連鎖平衡狀態(tài)。 為評估7個牛四核苷酸STR基因座在法醫(yī)學上的應用價值，對它們的檢測靈敏度、種屬特異性、重復性和實際檢案應用等進行了研究。應用銀染法檢測7個STR基因座的最小DNA模板量為2ng～10ng。用7對引物對牛、人、豬、羊、狗、貓、兔、小鼠和雞的DNA樣本進行檢測，僅牛在特異性片段范圍內檢見擴增產物。對肯定親緣關系的10例家系樣本進行檢測，7個STR基因座的分型結果均符合孟德爾遺傳規(guī)律。采集后放置一天

8、與放置一年的同一份血痕的檢測結果一致。來自同一個體的血痕和口腔拭子樣本的分型結果一致。對實際案件的檢驗證實，該分型系統(tǒng)可用于家養(yǎng)牛法醫(yī)DNA分析。 為建立7個牛四核苷酸STR基因座的復合擴增系統(tǒng)，將7個基因座分為3組，每組在正向引物的5’端標記相同顏色的熒光。通過正交實驗優(yōu)化PCR反應體系的組成和熱循環(huán)參數(shù)，并根據(jù)毛細管凝膠電泳的結果調整復合擴增體系中各基因座的引物濃度，以盡可能保持各基因座擴增效率的平衡。由于基因座FJ2320

9、26和FJ232025的引物加入復合擴增體系后，無法得到較好的電泳效果，故予以剔除，最后初步建立了家養(yǎng)?；蜃鵊18833、FJ232022、FJ232028、FJ232023和FJ232024的五重STR復合擴增體系。 結論：本實驗在?；蚪M序列中篩選出7個四核苷酸重復STR基因座：G18833、FJ232022、FJ232023、FJ232024、FJ232025、FJ232026、FJ232028，其中除G18833外為本