PCR抑制物消除技術(shù)比較研究及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、研究背景：隨著DNA的證據(jù)價值越來越受到重視，DNA分型技術(shù)在刑事案件的偵破中也逐漸被廣泛應(yīng)用。但復(fù)雜犯罪現(xiàn)場所提取的生物檢材，往往含有PCR抑制物，其對PCR反應(yīng)的影響使DNA檢測技術(shù)面臨巨大的挑戰(zhàn)。隨著DNA提取純化技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的新技術(shù)、新方法被運(yùn)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案，但各種方法能否有效去除現(xiàn)場檢材中PCR抑制物，國內(nèi)外學(xué)者尚未對此有深入探索及研究。因此，明確不同方法對不同抑制物的去除效果的差異可為法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案提供一定的

2、參考以便更有針對性地選擇合適的方法。
　　目的：通過比較不同純化技術(shù)對法醫(yī)學(xué)常見PCR抑制物去除效果，能更有針對性地根據(jù)不同的生物檢材樣本選擇合適的抑制物除去技術(shù)。
　　方法：選擇8種常見PCR抑制物膽汁酸鹽、膠原質(zhì)、腐殖酸、血紅素、黑色素、尿素，氯化鈣和靛青染料，分別將上述抑制物與K562 DNA混合后，使用Identifiler熒光擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行分型，以恰好抑制K562 DNA所有26個不同等位基因的抑制物濃度為工作濃度

3、，在此基礎(chǔ)上提高每種PCR抑制物的濃度，用DNA IQ(TM)System、PowerClean(R)DNA Clean-Up kit、酚/氯仿抽提法和Chelex(R)-100法對混有抑制物的標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行純化處理后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和STR分型檢測，統(tǒng)計(jì)STR基因座等位基因檢出個數(shù)。
　　結(jié)果：⑴分別混有1×、2×和4×工作濃度各種抑制物的K562DNA，經(jīng)DNA IQ(TM)System純化后，混有膽汁酸鹽、膠原質(zhì)、腐殖酸

4、、血紅素、黑色素、尿素和氯化鈣的DNA樣本均可檢出所有STR基因座的全部等位基因，而混有靛青染料的DNA樣本在1×工作濃度時平均檢出25個等位基因，在2×工作濃度時，平均檢出9個等位基因，在4×工作濃度時，平均檢出1.7個等位基因；⑵經(jīng)PowerClean(R)DNA Clean-Up kit純化后，混有膽汁酸鹽、膠原質(zhì)、腐殖酸、血紅素、黑色素、尿素的DNA樣本均可檢出所有STR基因座的全部等位基因，混有氯化鈣的DNA樣本在1×、2×工

5、作濃度時可檢出所有STR基因座的全部等位基因，在4×工作濃度時平均檢出24.3個等位基因，混有靛青染料的DNA樣本在1×工作濃度時，平均檢出25個等位基因，在2×工作濃度時，平均檢出14個等位基因，在4×工作濃度時，平均檢出1.3個等位基因；⑶經(jīng)酚/氯仿法純化后，混有血紅素、尿素、膽汁酸鹽的DNA樣本可檢出所有STR基因座的全部等位基因，混有膠原質(zhì)、腐殖酸、黑色素的DNA樣本無法檢出STR基因座，混有氯化鈣的DNA樣本在1×工作濃度時平

6、均檢出1.7個等位基因，在2×、4×工作濃度時無法檢出等位基因，混有靛青染料的DNA樣本在1×工作濃度時，平均檢出25.7個等位基因，在2×工作濃度`時，平均檢出20.7個等位基因，在4×工作濃度時，無法檢出等位基因；⑷經(jīng)Chelex(R)-100法純化后，混有膠原質(zhì)的DNA樣本可檢出所有STR基因座的全部等位基因，混有腐殖酸、黑色素、血紅素、尿素的DNA樣本無法檢出STR基因座，混有膽汁酸鹽的DNA樣本在1×工作濃度時平均檢出26個等

7、位基因，在2×、4×工作濃度時無法檢出等位基因，混有靛青染料的DNA樣本在1×工作濃度時，平均檢出25.7個等位基因，在2×工作濃度時，平均檢出6.3個等位基因，在4×工作濃度時，無法檢出等位基因，混有氯化鈣的DNA樣本在1×工作濃度時，平均檢出23.7個等位基因，在2×、4×工作濃度時，無法檢出等位基因。
　　結(jié)論：⑴通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)以上八種常見抑制物對PCR擴(kuò)增反應(yīng)都有明顯的抑制作用，在對DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增前必須盡可能去除；

8、⑵DNA IQ(TM) System和PowerClean(R)DNA Clean-Up kit相較于傳統(tǒng)的DNA純化方法，如有機(jī)法和Chelex-100法，有其明顯的優(yōu)勢，能十分有效地去除目前法醫(yī)學(xué)常見的PCR抑制物，且兩種方法對八種抑制物的去除效果無明顯差異；⑶本文所使用的DNA IQ(TM) System和PowerClean(R)DNA Clean-Up kit操作步驟簡單、結(jié)果穩(wěn)定性高、抑制物去除效率高，可以為法醫(yī)工作者針對含