應(yīng)用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析線(xiàn)粒體DNA多態(tài)性及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究.pdf

1、國(guó)內(nèi)外法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室采用的DNA遺傳標(biāo)記分為兩大類(lèi)：核基因組DNA和線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)。與細(xì)胞核DNA相比，mtDNA有許多無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如拷貝數(shù)高、對(duì)樣木質(zhì)量要求不高、對(duì)樣木需求量低。這此特點(diǎn)非常適合用于細(xì)胞數(shù)量極少或嚴(yán)重降解的法庭科學(xué)生物樣本，如骨骼、毛發(fā)、指甲、微量血痕等分析。因此在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，mtDNA的應(yīng)用日益廣泛。此外，除了滿(mǎn)足法醫(yī)物證學(xué)個(gè)體識(shí)別和親緣關(guān)系鑒定這兩項(xiàng)基本要求外，它已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用于法庭科學(xué)的各個(gè)方面。

2、 近年來(lái)，mtDNA的研究不斷深入，線(xiàn)粒體DNA檢出在很大程度上依賴(lài)檢測(cè)方法的靈敏度，所以選擇合適的分析技術(shù)就顯得非常重要。就目前而言，在諸多的有關(guān)mtDNA的檢測(cè)方法中，直接測(cè)定序列分析是使用最多、最廣的方法。測(cè)序法要求有測(cè)序儀及相應(yīng)的試劑盒，費(fèi)用昂貴，操作費(fèi)時(shí)，且對(duì)操作人員本身素質(zhì)要求高，周期長(zhǎng)，實(shí)際應(yīng)用常受到限制，在基層難以開(kāi)展。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism

3、，SSCP)和限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(Rrestriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)是經(jīng)典的突變篩選技術(shù)，突出特點(diǎn)是成本低，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，周期短，非常適于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)技術(shù)分型。 目的：鑒于mtDNA特有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)多等特點(diǎn)，對(duì)降解和腐敗有更強(qiáng)的抵抗力，在骨骼、毛發(fā)等特殊生物檢材的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中發(fā)揮了重要作用，為了建立一種適合于基層實(shí)驗(yàn)室分析的技術(shù)，本研究將利用PCR—SSC

4、P和PCR—RFLP方法進(jìn)行線(xiàn)粒體DNA多態(tài)性進(jìn)行分析，為法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別、親權(quán)鑒定及群體遺傳學(xué)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 方法：1、150例遼寧漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體及30例兩代家系血液樣品200μl、5例死后12h的各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦)0.5cm×0.5cm×0.5cm和5例甲醛固定石蠟包埋的組織切片(6μm厚)均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。2、利用primer5.0設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)PCR—SSCP和PCR—RFL

5、P方法分析線(xiàn)粒體DNA多態(tài)性。利用兩種技術(shù)分別對(duì)150例遼寧漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行分析，獲得單倍型頻率，并進(jìn)行組織一致性檢驗(yàn)以及在親權(quán)鑒定和降解檢材的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。 結(jié)果：1、用PCR—SSCP法獲得樣品清晰的單倍型圖譜，150份無(wú)關(guān)個(gè)體血樣檢出9種單倍型，DP值分別為0.8809。在150例隨機(jī)個(gè)體中，RsaI和MnlI酶切分別發(fā)現(xiàn)3和8種表型，DP值分別為0.1073，0.6698。聯(lián)合兩種酶切，發(fā)現(xiàn)12種表型，DP值為0.70

6、78。應(yīng)用兩種技術(shù)對(duì)150例隨機(jī)個(gè)體發(fā)現(xiàn)33種組合單倍型，DP值為0.925。2、在5例正常組織中，各個(gè)組織的RFLP帶型和SSCP帶型完全相同。3、在30個(gè)家系中，母子的RFLP帶型和SSCP帶型完全相同。4、5例甲醛固定包埋組織的RFLP分型和SSCP分型與對(duì)照組織一致。 結(jié)論：1、PCR—RFLP和PCR—SSCP方法用于法醫(yī)物證的初步篩查簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)，適合作為基層實(shí)驗(yàn)室線(xiàn)粒體DNA分析的常規(guī)方法。2、mtDNA HV