山羊三種病原行性研究與PCR-RFLP分析.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病，該疾病感染不同年齡階段的山羊，常引起胸腔的病變，其臨床特征為高熱、咳嗽、呼吸困難、纖維素性胸膜肺炎、肺肝變和胸腔積液，具有很高的發(fā)病率和死亡率。本試驗從重慶渝北、北碚，西藏山南等地區(qū)的病死山羊采集病料，采集部位主要為肺臟、鼻腔拭子、胸腔積液，其次為心血、肝臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等；采用改良型Hart

2、leys培養(yǎng)基，普通瓊脂、鮮血瓊脂和LB瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)病原，從68只病死山羊分離到14株病原菌，其中4株支原體，5株山羊奇異變形桿菌，5株大腸桿菌；本試驗對山羊傳染性胸膜肺炎等病原進行分離鑒定、克隆測序、動物試驗、藥敏試驗及部分生物學特性研究，為CCPP的診斷和預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。
　　 1.山羊支原體的分離鑒定
　　 為了研究CCPP病原，采用改良型Hartleys培養(yǎng)基，從病羊肺臟分離病原。對分離株進行糖發(fā)酵、精氨

3、酸水解、尿素分解、四氮唑還原、膜斑形成、固醇需要等生化試驗，動物試驗及藥敏試驗；根據(jù)絲狀支原體簇成員共有的16S rDNA特異性片段設(shè)計引物，進行PCR擴增。分離到4株病原，編號分別為BB3、BB7、BB42、YB2；生化試驗結(jié)果表明分離株BB7、BB42生化特性與標準株P(guān)G3相同，分離株BB3、YB2生化特性與PG3存在差異；BB7、YB2對小鼠有致病性，BB3、BB42對小鼠無致病性；分離株對頭孢噻呋鈉的MIC值最低，說明分離株對頭

4、孢噻呋鈉最敏感，其次為泰樂菌素、紅霉素、氟苯尼考等，而對林可霉素不敏感；分離株和標準株均擴增出548 bp片段。結(jié)果表明分離株屬于絲狀支原體簇。
　　 2.山羊奇異變形桿菌的分離鑒定及克隆測序
　　 為了分離鑒定病原，采用普通瓊脂、鮮血瓊脂和LB瓊脂培養(yǎng)基，從病死山羊肺臟等分離病原菌，對分離株進行游散行為分析、生化鑒定、動物試驗和藥敏試驗；根據(jù)細菌16S rDNA序列設(shè)計引物，對分離株進行PCR擴增和克隆測序。分離到5株

5、病原菌；分離株培養(yǎng)2.5 h-3.5 h開始遷徙，遷徙距離主要隨培養(yǎng)時間的延長而增加，遷徙速度2.5 h-4.5 h呈增長趨勢，5 h-5.5 h呈下降趨勢；在相同的培養(yǎng)時間下，分離株在0.5％瓊脂的培養(yǎng)基上遷徙距離最遠，其次為1.0％、1.5％、2.0％瓊脂，說明遷徙距離與瓊脂濃度呈負相關(guān)關(guān)系；分離株具有奇異變形桿菌的基本生化特性；分離株均對小鼠有致病性，LD50為2.5000×107 cfu·mL-1～4.4453×107cfu·m

6、L-1；分離株對丁胺卡那霉素、頭孢他啶敏感，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考等藥物不敏感；分離株擴增出1535 bp條帶，與奇異變形桿菌的同源率為99.5％～99.8％。分離株鑒定為奇異變形桿菌。
　　 3.山羊奇異變形桿菌毒力因子zapA基因的克隆及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
　　 為了研究山羊奇異變形桿菌的毒力因子，克隆zapA基因和預(yù)測推導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)。采用PCR方法，對山羊奇異變形桿菌毒力因子zapA

7、基因進行擴增、克隆及序列測定；利用生物信息學軟件預(yù)測ZapA蛋白的信號肽、跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位。結(jié)果表明，zapA基因長為1476 bp，編碼491個氨基酸，與參考株的核苷酸序列同源性為99.59％，氨基酸同源性為99.59％；ZapA蛋白存在信號肽，無跨膜區(qū)；B細胞表位可能位于69-71，78-84，136-139，197-199，353-356，371-373，472-474氨基酸區(qū)域內(nèi)或附近。山羊奇異變形桿菌存在毒力因

8、子zapA基因，ZapA蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測為蛋白的表達及基因工程疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。
　　 4.山羊奇異變形桿菌PCR-RFLP分析
　　 為了研究山羊奇異變形桿菌的多態(tài)性，對分離株16S rDNA和zapA基因進行RFLP分析。采用PCR方法，分別擴增分離株的16S rDNA和zapA基因，膠回收PCR擴增產(chǎn)物；選用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ對16S rDNA基因進行RFLP分析，選用內(nèi)切酶Bal1、DraⅠ、

9、VspⅠ對zapA基因進行RFLP分析；EcoRⅠ酶切產(chǎn)生868 bp、667 bp片段，HindⅢ酶切產(chǎn)生1462 bp、73 bp片段，BalⅠ酶切產(chǎn)生633bp、474 bp、369 bp片段，DraⅠ酶切產(chǎn)生796 bp、627 bp、49 bp、4 bp片段，VspⅠ酶切產(chǎn)生864 bp、411 bp、115 bp、86 bp片段，均與電子酶切結(jié)果相符。結(jié)果表明分離株16S rDNA和zapA基因均未產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性，

10、酶切位點未發(fā)生改變，說明16S rDNA和zapA基因在一定程度上具有很高的保守性。
　　 5.山羊大腸桿菌的分離鑒定及克隆測序
　　 為了分離鑒定病原，采用普通瓊脂和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，從病死山羊肺臟等分離病原，對分離株進行生化鑒定、動物試驗和藥敏試驗；根據(jù)細菌16S rDNA序列設(shè)計引物，對分離株進行PCR擴增和克隆測序。分離到5株病原菌，分離株具有大腸桿菌的生化特性；分離株均對小鼠有致病性，LD50為4.8395×10