豬三種主要繁殖障礙病原多重PCR檢測方法的建立.pdf

1、目前豬瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、豬偽狂犬(Porine pseudorabies virus，PRV)、豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是導(dǎo)致豬繁殖障礙疫病的主要病原。這三種病原常出現(xiàn)混合感染，增加了鑒別診斷難度。多重PCR方法具有特異性好、敏感性高且可同時檢測多種病原的優(yōu)點更適于疫病診斷

2、。
　　本實驗針對CSFV、PRRSV和PRV的高保守區(qū)域設(shè)計了3對引物分別用于擴增其目的基因序列，擴增產(chǎn)物大小分別為570bp、232bp、173bp。對三個單一PCR方法分別進行了退火溫度、引物濃度、酶濃度和Mg2+濃度的優(yōu)化，最終確定退火溫度為54℃，上下游引物(10μmol/L)加入量為1μL，酶（5μ/μL）加入量為0.5μL，Mg2+(25 mM)終濃度為3mM。在此基礎(chǔ)之上，建立了檢測PRRSV和PRV的雙重PCR方

3、法及檢測CSFV、PRRSV和PRV的多重PCR方法。經(jīng)條件優(yōu)化后的雙重PCR方法退火溫度為54℃，PRRSV和PRV上下游引物(10μmol/L)最佳用量為1μL，酶（5μ/μL）加入量為0.5μL，Mg2+(25 mM)終濃度為4mM。多重PCR檢測方法的反應(yīng)條件中退火溫度確定為54℃，Mg2+(25 mM)終濃度確定為5mM，各上下游引物(10μmol/L)加入量確定為1μL，酶(5μ/μL)加入量為1μL。該方法可以檢測到的CS

4、FV、PRRSV和PRV最低含量分別為23.88pg、13.1pg、14.6pg。
　　利用本試驗所建立的多重PCR檢測方法對從河北省9個市縣收集的168份臨床出現(xiàn)繁殖障礙癥狀豬的組織樣品進行檢測。結(jié)果顯示，CSFV、PRRSV、PRV的單純感染分別為41例、36例和11例，陽性率分別為24.4％、21.4％和6.6％。CSFV與PRRSV、PRRSV與PRV、CSFV與PRV的混合感染分別為10例、1例和2例，陽性率分別為5.9